[發明專利]一種建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法

無效

• 申請號: 201010184808.1
• 申請日: 2010-05-28
• 公開（公告）號: CN101864485A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 米鐵柱;張濤;甄毓;于志剛
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 吳蔭芳

1.一種建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、模擬實驗數據表的建立

b、模擬酶切電泳圖譜

c、模擬酶切和實際酶切對照實驗

d、實際酶切實驗

e、模擬酶切實驗

f、模擬酶切實驗和實際酶切實驗結果的對比

g、酶切實驗條件優化

h、RFLP圖譜的建立

i、基于RFLP技術的赤潮藻種鑒定。

2.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟a為：將實驗藻種序列信息錄入excel軟件，并結合實驗用到的限制性內切酶的酶切信息，通過excel軟件，作出酶切片段數和長度的信息，建立初級酶切信息數據表。

3.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟b為：根據步驟a模擬數據表建立的信息，進行篩選，從中挑選出限制性內切酶，運用Vector?NTI?Suite?9軟件確定凝膠電泳的條件，然后對實驗藻種序列進行模擬的酶切，并跑出模擬電泳圖，根據此初步判斷其區分鑒別程度。

4.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟c為：選取部分實驗藻種進行酶切實驗，并與的模擬實驗結果進行比對，驗證模擬實驗和實際試驗的吻合程度，其中，

反應體系為：總體積30μl，其中18S?rDNA擴增產物15μl，酶切反應緩沖液5μl，內切酶3μl，滅菌重蒸水7μl；

反應時間為：65℃條件下90min，其酶切產物也用凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝膠濃度為1％，電壓100V，電泳30min，然后在凝膠成像系統中進行分析。

5.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟d為：選取實驗藻種對選擇的限制性內切酶進行實驗，作出酶切電泳圖，作出單個的藻種酶切圖譜，用于鑒別和區分，并對相關酶切實驗條件進行優化。

6.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟e為：對照模擬實驗結果和實際實驗結果，構建赤潮藻種的RFLP圖庫，并在此基礎上建立標準化的基于RELP技術的赤潮藻種分類鑒定方法，對試驗藻進行了五次的重復實驗，并計算條帶大小。

7.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟f為：收集實驗藻種18S?rDNA序列信息，并綜合主要限制性內切酶的信息，結合數據庫和Vector?NTI?Suite?9軟件，選取用酶，作出模擬電泳圖，優選為Taq?I酶作為實驗用酶；計算模擬實驗和實際實驗的對比結果，計算實際實驗的條帶數和條帶大小的位置是否與擬實驗結果基本一致。

8.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟g為：

(1)酶切樣品量的優化：取三個酶切對象的量進行優化，分別是5μl、10μl、15μl，然后進行電泳分析；

(2)酶切時間的優化：取5個時間段對本實驗進行優化，分別是90min、120min、150min、180min、210min然后進行電泳分析；

(3)酶切用酶量的優化：取三個酶的用量對本實驗進行優化，分別是2μl、3μl、4μl；然后進行電泳分析。

9.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟h為：對各驗藻種進行了RFLP酶切實驗，在酶切之后固定凝膠濃度以及電泳的電壓、電泳時間因素，并作出其酶切圖譜，用于鑒別和區分藻種。

10.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟i為：對未知藻種進行培養，提取DNA，對藻種進行擴增，得到目的片段后對目的片段進行酶切，酶切后進行電泳，得到電泳圖譜后對電泳圖譜進行分析，對電泳圖譜的分析，應根據電泳圖譜中酶切樣品的片段數以及片段和marker的相對位置來確定，其中，

條帶片段大小估算公式：

L＝(W×C)+D

L：為條帶分子量

W：目標條帶所處的兩條marker之間的比例位置

C：為條帶所處的兩條marker片段差值

D：兩條marker條帶中較小的一條的分子量

誤差為±C/10，(C為marker兩條帶之差值)。