[發明專利]一對大白菜蕪菁花葉病毒病EST-SSR標記及其應用

無效

• 申請號: 201010180024.1
• 申請日: 2010-05-24
• 公開（公告）號: CN101838645A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發明（設計）人: 李巧云;佟海申;張志剛;宋希云;趙智中;劉栓桃
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院蔬菜研究所;青島農業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 王汝銀

技術領域

本發明涉及一對EST-SSR標記，尤其是與大白菜蕪菁花葉病毒(TuMV)抗病和感病基因緊密連鎖的EST-SSR標記，屬于生物技術領域。

背景技術

大白菜(Brassica?rapa?L.ssp.pekinensis)原產于我國，是我國乃至日本、朝鮮、韓國等國家的重要蔬菜。病毒病是我國大白菜的三大病害之一，平均每年造成5％的產量損失，有些年份減產10％以上，病害嚴重的地塊幾乎絕收。該病防治困難，目前，還沒有可以普遍適用的抗病毒病藥劑或其它行之有效的控制技術，培育抗病品種仍然是一條最有效且可持續的防治措施。但常規育種程序繁瑣，在抗性選擇時，表型觀測困難，選育時間較長，另一方面抗性遺傳易受環境條件的影響，選擇準確度不高，難以適應生產的需要。采用分子標記輔助育種可大大加快育種進程。研究表明，我國大白菜病毒病主要是由三種病毒單獨或復合浸染所致，即蕪菁花葉病毒病(Turnip?mosaic?virus，簡稱TuMV)、黃瓜花葉病毒病(Cucumber?mosaic?virus，簡稱CMV)和煙草花葉病毒病(Tobacco?mosaicvirus，簡稱TMV)。其中，TuMV是主要病原，占病毒分離物的71.9％。因此，篩選與大白菜TuMV抗性有關的分子標記對指導今后大白菜抗病毒病育種具有重要意義。

國內外許多學者報道過這方面的研究。如閆瑾琦(2000)采用RAPD方法找到2個與大白菜抗TuMV基因緊密連鎖的標記，遺傳距離分別為9.5cM和15.36cM。韓和平等(2004)篩選到2個與大白菜TuMV感病基因緊密連鎖的AFLP分子標記，其遺傳距離分別為7.5和8.4cM。張俊華等(2006)篩選出2個與大白菜TuMV-C3株系抗病基因緊密連鎖的EST-PCR-RFLP分子標記BS300及BS160，遺傳距離均為6.5cM。Gao等(2008)以甘藍為材料，采用BSA法，篩選到兩個與TuMV抗性基因連鎖的RAPD分子標記，連鎖距離分別為7.7c?M和8.38cM，并將其轉化為SCAR標記。但相對于實際應用，這些標記的連鎖遺傳距離還較遠。一般情況下，5cM以下的分子標記才有應用價值。張曉偉等(2009)篩選到3個與大白菜TuMV抗性有關的QTLs連鎖距離分別為2.9cM、2.4cM和0.5cM的AFLP標記，但均為顯性標記，在后代選擇中難以區分純合體和雜合體。因此，篩選與大白菜TuMV抗性基因連鎖距離在5cM以下且呈共顯性的EST-SSR分子標記具有重要意義。

發明內容

為了克服現有分子標記在大白菜抗TuMV育種輔助選擇應用中的不足，本發明提供一對連鎖距離為3.8cM且呈共顯性的EST-SSR分子標記，該對分子標記不僅能用于大白菜抗TuMV育種輔助選擇，而且能在后代選擇中區分純合體和雜合體，從而有利于抗病材料的快速篩選和純化。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：一對大白菜蕪菁花葉病毒病EST-SSR標記，其特征是，其為一對等位標記ATA157和ATA154，與大白菜TuMV抗性位點間的連鎖距離為3.8cM，其中，標記ATA157的片段長度為157bp，具有序列表SEQ?ID?No.1中的序列；標記ATA154的片段長度為154bp，具有序列表SEQ?ID?No.2中的序列。

標記ATA157基因序列：

GCAAAACGGAGTACCCTAACGCCTTCATCAGGATCATCGGATTCGACAACAACCGTCAAGTCCAGTGCATCAGTTTCATCGCCTACAAGCCACCAAGCTTCACCGGTGCTTAATTCGCTTTCATATAATAATAATATCTTCTCATTTCATTTCCAAA(SEQ?ID?No.1)

標記ATA154基因序列：

TTGGAAATGAAATGAGAAGATATTATTATATGAAAGCGAATTAAGCACCGGTGAAGCTTGGTGGCTTGTAGGCGATGAAACTGATGCACTGGACTTGACGGTTGTTGTCGAATCCGATGATCCTGATGAAGGCGTTAGGGTACTCCGTTTTGCA(SEQ?ID?No.2)

本發明大白菜蕪菁花葉病毒病EST-SSR標記的制備方法：

(1)采用改良CTAB法提取待測驗單株的基因組DNA