[發(fā)明專利]一種修飾性谷胱甘肽過(guò)氧化物酶及其制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010179067.8
• 申請(qǐng)日: 2010-05-14
• 公開（公告）號(hào): CN101831413A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳芳艷;馮定遠(yuǎn);王林川
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/08
• 分類號(hào): C12N9/08;C12N9/96
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種修飾性谷胱甘肽過(guò)氧化物酶及其制備方法。

背景技術(shù)

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione?peroxidase，EC1.11.1.9，簡(jiǎn)稱GPx)是生物機(jī)體組織中存在的三種重要的抗氧化酶之一，也是一種重要的含硒酶，硒是該酶活性中心的構(gòu)成成分。它可以消除機(jī)體內(nèi)的過(guò)氧化氫及脂質(zhì)過(guò)氧化物，阻斷活性氧自由基對(duì)機(jī)體的進(jìn)一步損傷，是生物體內(nèi)重要的活性氧自由基清除劑，它以硒代半胱氨酸(Sec)的形式發(fā)揮作用，以谷胱甘肽(GSH)為還原劑分解體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化物，因而可防止細(xì)胞膜和其它生物組織免受過(guò)氧化作用的損傷；它與體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)一起構(gòu)成了機(jī)體的抗氧化防御體系。醫(yī)學(xué)研究表明它與人類許多疾病有關(guān)，對(duì)腫瘤、心血管疾病、老年性疾病、不孕癥等多種疾病有著良好的預(yù)防和治療作用，是一種有廣泛應(yīng)用和市場(chǎng)前景的醫(yī)藥用酶。但該酶在常溫條件下其巰基易氧化而使酶失活、半衰期非常短、穩(wěn)定性差等特性限制了該酶的以常態(tài)形式使用的實(shí)用性。對(duì)該類酶進(jìn)行化學(xué)修飾以提高其物理、化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性是成功開發(fā)并推出市場(chǎng)的關(guān)鍵性技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種酶活性高、穩(wěn)定性強(qiáng)的修飾性谷胱甘肽過(guò)氧化物酶。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供制備該修飾性豬谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的方法。

本發(fā)明公開了一種修飾性谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，由谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的氨基與活化的單甲氧基聚乙二醇連接，其結(jié)構(gòu)式為：

其中GP_x表示谷胱甘肽過(guò)氧化酶。

本發(fā)明同時(shí)公開了該修飾性谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的制備方法，采用活化的單鏈單甲氧基聚乙二醇作為修飾劑，與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶反應(yīng)，將單鏈單甲氧基聚乙二醇(mPEG₁)通過(guò)游離氯原子與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的氨基發(fā)生反應(yīng)，使mPEG₁與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶連接。反應(yīng)式為：

本發(fā)明同時(shí)也公開了該修飾性谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的制備方法，包括以下步驟：采用活化的單鏈單甲氧基聚二醇作為修飾劑，與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶在4-37℃、pH?7.0-10.0下反應(yīng)，其中單鏈單甲氧基聚二醇與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的質(zhì)量比為20-100∶1。反應(yīng)15-60min后，加入終止劑GSH結(jié)束反應(yīng)，超濾去除終止劑，獲得所述的修飾性谷胱甘肽過(guò)氧化物酶。

其中，優(yōu)選的方案為：?jiǎn)捂渾渭籽趸鄱寂c谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的質(zhì)量比為80∶1；反應(yīng)條件為溫度15℃、pH?9.0、時(shí)間45min。

其中的活化的單鏈單甲氧基聚二醇，可以通過(guò)以下方法獲得：取5.5g二次重結(jié)晶的三聚氰氯(先用無(wú)水苯重結(jié)晶兩次)溶解于400mL含10g無(wú)水碳酸鈉的無(wú)水苯中，加入50g?mPEG-5000，室溫下攪拌過(guò)夜，過(guò)濾，取濾液約400mL攪拌下緩慢加入600mL乙醚，沉淀出白色產(chǎn)物后繼續(xù)攪拌20min，抽濾，沉淀再用400mL無(wú)水苯溶解，如此沉淀、溶解重復(fù)多次，直到紫外檢測(cè)無(wú)三聚氰氯的吸收峰為止。將活化的mPEG₁置于真空干燥器中抽干，得到白色粉末，即獲得活化mPEG₁。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明首次采用單鏈單甲氧基聚乙二醇(mPEG₁)修飾谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，經(jīng)過(guò)測(cè)定殘余氨基修飾率(DTNB法)鑒定，其氨基修飾率為44.55％；由于氨基修飾率達(dá)40％以上時(shí)進(jìn)入體內(nèi)就可完全消除異體蛋白的抗原抗體反應(yīng)，因此本發(fā)明的修飾性谷胱甘肽過(guò)氧化物酶具有消除酶蛋白抗原抗體反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。

(2)本發(fā)明所獲得的修飾性谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，酶活力保持率高達(dá)104.66％，即修飾酶活力比天然酶的活力更高。

(3)酶的pH穩(wěn)定性與熱穩(wěn)定性提高。與天然酶相比，修飾酶的pH穩(wěn)定性要寬一些，在pH4.0和pH10.0的條件下放置1.5h，天然酶的相對(duì)活力分別為0％和38.83％，而修飾酶的相對(duì)活力分別為21.08％和68.79％；熱穩(wěn)定性也比天然酶高一些，在50℃時(shí)未修飾GPx的相對(duì)活力為0％，而修飾GPx保持了37％的活力。

(4)修飾酶的半衰期比天然酶延長(zhǎng)了。修飾酶的半衰期為180.77h，天然酶的半衰期為76.28h，修飾酶的半衰期是原酶的2.37倍