[發明專利]一種適于流式細胞分析的果樹成熟葉片細胞核提取方法

無效

• 申請號: 201010175029.5
• 申請日: 2010-05-14
• 公開（公告）號: CN102243150A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 吳雅琴;程和禾;趙艷華;吳永杰;李玉生
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院昌黎果樹研究所
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30;G01N33/50
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 張慶敏;楊靜

技術領域

本發明涉及一種細胞核提取方法，具體地說，涉及一種適于流式細胞分析的果樹成熟葉片細胞核提取方法。屬于細胞生物學領域。

背景技術

流式細胞術(flow?cytometry，FCM)是利用流式細胞儀(flowcytometer)分析測定細胞核DNA含量的方法。流式細胞儀是進行流式細胞分析的儀器，它集電子技術、計算機技術、激光技術、流體理論于一體，是一種非常先進的檢測分析儀器，被譽為實驗室的“CT”。該技術可對處于快速流動中的微小生物顆粒(細胞、細胞核、染色體等)進行多參數、快速定量分析和分選。在植物遺傳和育種研究中，則可用于植物倍性鑒定、細胞核DNA數量(基因組大小)測定、生殖途徑鑒定等。但是，由于植物細胞核的懸液制備困難，致使該技術在植物細胞生物學中的應用較為滯后。

利用流式細胞儀可快速準確地鑒定各種植物的倍性，但分析鑒定的結果受到待檢樣品細胞核提取的濃度和純度影響，如果樣品核懸液中細胞核的濃度太低，則在分析圖中出現的峰會很低，令結果無法判斷；如果樣品核懸液中雜質較多，分析圖中出現的峰較寬，雜質峰高，同樣無法準確判斷結果，因此待檢樣品細胞核提取的濃度和純度決定流式細胞儀分析結果的可靠性。

在已報道的研究中，普遍要求植物材料必須是嫩葉或幼嫩的莖尖組織，所以目前國內外在進行流式分析時樣品的選擇都以幼嫩組織為好，是因為其可以避免老組織內含有較高濃度的淀粉、多糖、磷酸鈣和其他一些新陳代謝之類的粘性物質，而這些物質分布在細胞質中，使得細胞質緊密地和細胞核粘在一起，影響了細胞核的純度，這些物質同時也加速了細胞核的老化，增加了樣品的粘度，阻礙了流式細胞儀中鞘液的流動，使得其不能準確地檢測出待測樣品的倍性，因此流式細胞儀分析的準確性與植物細胞核提取方法有直接關系。

由于粘度過高的植物材料，材料狀態、取材部位和細胞核提取方法直接影響流式細胞儀的檢測結果，目前基本上采取選擇新鮮、幼嫩的植物材料并通過提取方法的改進來消除材料本身的粘性。李赟(1998)等蘋果、草莓采取的是試管苗嫩莖或幼葉；劉慶忠(2001)等人用離體蘋果新梢葉片，測定樣品單個細胞核的DNA總量；劉繼紅(2003)以二倍體粗檸檬幼嫩葉片為材料，盡管朱道圩(2007)為了防止中華稱猴桃葉中酚類和粘性物質的干擾，在前人工作基礎上，修改和優化了細胞核提取液配方和提取方法，仍然采用的是獼猴桃不定芽苗頂部葉片。

目前報道的實驗方法局限于采用幼葉或其他幼嫩組織，發明人也利用前人的緩沖液和提取方法來準備細胞核懸液，用流式細胞儀分析蘋果、葡萄、草莓和菠蘿等的試管苗和幼嫩葉片，取得了很好的檢測效果。但在分析田間蘋果樣品或細胞內黏性過高的樣品時，測定效果較差，而且容易堵塞儀器管道。在我們收到外單位送檢的樣品中，85％都是較老的田間材料，以成熟葉片居多。選擇新鮮、幼嫩的材料在果樹生產、育種中僅僅局限于初春剛萌發的葉片和試管苗，因此利用流式細胞儀進行分析受到極大的限制。

由此針對這些問題并借助前人的經驗，發明人進行了細胞核提取液配方優化和提取方法的改進，旨在延長流式細胞分析周期，提高DNA分辨率，增加樣品檢測的準確性和成功率，降低核懸液中雜質的濃度，減少雜質對流式細胞分析的影響，并且在分析的過程中，不會堵塞儀器管道，有利于流式細胞儀的保養。

發明內容

本發明的目的是提供一種適于流式細胞分析的果樹成熟葉片的細胞核提取方法，該方法可延長流式細胞分析周期，提高DNA分辨率，增加樣品檢測的準確性和成功率，降低核懸液中雜質的濃度，減少雜質對流式細胞分析的影響，并且在分析的過程中，不會堵塞儀器管道，有利于流式細胞儀的保養。

為了實現本發明目的，本發明提供一種適于流式細胞分析的果樹成熟葉片的細胞核提取方法，其所用的細胞核提取液組分為：

15-20mmol/L?Tris，40-60mmol/L的KCl，10-20mmol/L的NaCl，2-5mmol/L的Na₂EDTA，10-20mmol/L?MgSO₄，40-50mmol/L蔗糖和0.5-1.0％(v/v)Triton?X-100，加ddH₂O(去離子水)至200ml，調pH為7.5-8后，加入200μl的15mmol/L巰基乙醇。

本發明所述細胞核提取方法中所用的染色緩沖液為在細胞核提取液中加入20mg/L的RNA酶A和20mg/L?PI(碘化丙啶)(即1L細胞核提取液中加入20mg的RNA酶A和20mg?PI)。

本發明所述細胞核提取方法，其包括如下步驟：