[發明專利]一種含凝血酶片段融合肽

無效

• 申請號: 201010173373.0
• 申請日: 2010-05-17
• 公開（公告）號: CN102250253A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 李樹民;莘旭妮;李詠梅
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;A61K47/48;A61K38/17;A61P17/02;A61P27/02
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一.技術領域

本發明涉及新的凝血酶片段融合肽S-TP508。本發明還涉及含有所述S-TP508的藥物組合物。本發明還涉及所述S-TP508用于制備治療皮膚組織損傷與角膜損傷藥物的用途。本發明還涉及利用所述S-TP508治療皮膚組織損傷與角膜損傷的疾病的方法。

二.發明背景

凝血酶是由凝血酶原(Porthormbin)轉化而來的一種絲氨酸蛋白酶，在體內的主要作用是催化纖維蛋白原轉變成纖維蛋白，誘導血小板粘附、聚集和釋放等反應，是血小板的強誘導劑，因而在血液凝固中起重要作用。現已證明，凝血酶除了其血液凝固作用外，還可刺激成纖維細胞、表皮細胞增生等，在促進創面愈合方面也起重要作用。

TP508(凝血酶受體激活肽)是取自人凝血酶原分子序列第508～530個氨基酸殘基的片段，研究發現具有可特異性激活細胞表面的高親合性凝血酶受體，刺激細胞分裂和趨化，參與組織修復，刺激細胞增生和促進創面愈合的功能。

由于TP508是只有23個氨基酸組成的短肽(見序列為SEQ?ID?NO：1中12-34位氨基酸序列)，所以半衰期短，穩定性差。因而我們在TP508的N端加上了一段穩定肽(見序列為SEQID?NO：1中1-11位氨基酸序列)，這段穩定肽主要由谷氨酰胺和精氨酸組成。加入穩定肽的該融合蛋白較之TP508延長了半衰期，提高了穩定性。作為運用于人體的藥物，克服了TP508易被酸解的弱點，具有提高藥效、降低病人服藥量、延長有效期、減少成本等顯著的社會和經濟效益。

TP508分子量非常小，半衰期很短。本專利通過將一段具有穩定功能的短肽序列加到TP508的N端，顯著的提高了半衰期，穩定性也大幅的提高。本專利對TP508進行改造主要有以下理由：(一)TP508分子量比較小，半衰期短可以較好地解決此處肽鍵酸解斷裂的問題。(二)通過對融合肽的二級結構的模擬及根據相關文獻資料報道，發現加上了穩定肽不會影響TP508其二級結構和三級結構的形成，即保證改造后TP508生物活性的穩定。

三.發明內容

本發明的一個方面，涉及一種凝血酶片段融合肽，其為SEQ?ID?NO：1所示的S-TP508。

作為本發明中的融合蛋白，是一類自然界沒有的人工蛋白，其特征為穩定肽和TP508組成的融合蛋白，可以使用一種具有序列表中SEQ?ID?NO1的序列，也可以使用對序列表SEQ?ID

NO1中融合蛋白的氨基酸序列加以修飾，如插入，缺失，突變某個或某些氨基酸而得到的序列，只要基本保持原分子的生物活性即可。換句話說，也可以使用采用其氨基酸序列大體上與序列表SEQ?ID?NO1中融合蛋白氨基酸序列相同的蛋白，即使用氨基酸序列具有大于等于90％序列同一性的變體或其功能性片段。

本領域普通技術人員知曉，所述S-TP508可以通過基因重組表達的方法或者化學合成的方法制備。在本發明中，所述S-TP508是通過基因工程重組表達的方法獲得的。

在本發明的一個實施方案中，通過如下方法獲得S-TP508，包括如下步驟：

1)表達載體的構建

依據已知S-TP508氨基酸序列(SEQ?ID?NO：1)，選用大腸桿菌偏好密碼子全基因合成目的基因序列，同時在相應于所編碼的氨基酸序列之N末端和C末端加上限制性酶切位點，得到S-TP508的核酸序列。再分別將如上述制備的目的基因序列以及篩選質粒pBSK用限制性內切酶處理好，經計算各樣品濃度后按一定摩爾比加入T4連接體系。經轉化、篩選成功的重組子。

用限制性酶切下目的基因，再將該基因與用限制性酶處理好的本研究所質粒pGM(該質粒為卡那霉素抗性篩選標記，能大量表達GST類融合蛋白，為本研究所構建)連接，經篩選得到正確地重組子。

2)目的蛋白的表達及分離純化

將如上述所得重組子轉化到表達宿主菌，經表達篩選出高表達基因工程菌，然后經發酵，得到目的蛋白高表達的工程菌。高壓均質機破碎細菌并離心得到含目的前體蛋白上清液，將上清液上樣到GST親和柱上，洗脫目的前體蛋白并用蛋白酶酶切后，再將樣品通過陰離子柱進一步純化，使得最終蛋白純度大于98％的終產物。

本發明的另一方面，涉及一種藥物組合物，其含有本發明所述的S-TP508，以及任選的藥物上可接受的載體。

在本發明知，術語“藥物上可接受的”意味著制藥領域公認的可用于動物，更特別的是可用于人的。術語“載體”指稀釋劑、佐劑(例如(完全或不完全)弗氏佐劑)、賦形劑、或用于容納或施用治療劑的介質。