[發明專利]草魚呼腸孤病毒SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201010173229.7
• 申請日: 2010-05-10
• 公開（公告）號: CN101831507A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 周勇;曾令兵;范玉頂;羅曉松;徐進;馬杰
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院長江水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 荊州市技經專利事務所 42219
• 代理人: 韓志剛

技術領域

本發明涉及到生物醫藥體外分子診斷技術領域，特別涉及到草魚呼腸孤病毒SYBR?GreenI實時熒光定量PCR檢測方法。

背景技術

草魚出血病(Hemorrhagedisease?of?grasscarp)是感染草魚的一種嚴重的傳染性疾病。流行季節長，發病率和死亡率均較高，往往造成大批草魚魚苗死亡；1年足齡青魚也受害，2齡以上草魚有時也患此病。草魚出血病的病原出于草魚呼腸孤病毒(Grass?Carp?Reovirμs，GCRV)，是呼腸孤病毒科、水生呼腸孤病毒屬的病毒中毒力最強的病毒。草魚呼腸孤病毒基因組由11條分節段dsRNA組成，總分子量為15.46×10⁶道爾頓，編碼了12條多肽，研究表明，各基因組片段與編碼多肽的關系是大體一一對應。

目前對GCRV的檢測方法包括：免疫學方法如葡萄球菌A蛋白協同凝集試驗(SPA-COA)法、熒光抗體技術(FA)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法和斑點酶聯免疫吸附試驗(Dot-ELISA)法；分子生物學方法如逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。這些方法或者操作繁瑣，周期長，或者只能進行定性檢測而不能定量分析。最近發展起來的熒光定量PCR技術，以其靈敏度高，特異性好、快速、準確等優點，在病原體的定性和定量檢測等方面得到廣泛應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于草魚呼腸孤病毒可疑患病草魚肝、脾、腎組織的草魚出血病基因診斷的SYBR?GreenI實時熒光定量PCR檢測方法。

為達到上述目的，本發明的具體技術方案為：

草魚呼腸孤病毒SYBR?GreenI實時熒光定量PCR檢測方法至少包括：抽提草魚呼腸孤病毒總RNA、引物設計、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白基因RT-PCR擴增、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白基因的克隆與鑒定、標準品模板的稀釋和熒光定量PCR反應標準曲線的建立。

草魚呼腸孤病毒SYBR?GreenI實時熒光定量PCR檢測方法的具體步驟如下：

1、采用裂解液和RNA抽提液處理抽提的草魚呼腸孤病毒總RNA；

2、引物設計：根據GenBank中草魚出血病-873外衣殼蛋白(VP7)基因序列(AF403396)設計兩對特異性引物，擴增片段長度為100bp的片段，所設計的引物如下：

上游引物：5’-GGAATTCACCACGATGCCACTTCAC-3’

下游引物：5’-CGGGATCCCGGTGCTTAATCGGATGG-3’；

3、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因RT-PCR擴增：

取1～10μg病毒總RNA，加入上游引物，進行反轉錄，取反轉錄產物cDNA，加入反應緩沖液，dNTPs、上下游引物、滅菌雙蒸水，Taq?DNA聚合酶，將上述反應體系混勻后進行PCR擴增，PCR產物進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收產物；

4、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因的克隆與鑒定：

草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因擴增產物經膠回收純化后于14～25℃過夜與載體連接，用連接產物轉化感受態細胞，從LB瓊脂平板上挑取菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基中，28～37℃震蕩培養過夜，使用質粒DNA小量提取試劑盒提取質粒，對重組質粒用上下游引物進行PCR鑒定；

5、標準品模板的稀釋：

用紫外分光光度計分別測定陽性重組質粒在260和280納米處的吸光度，并根據公式計算重組質粒的DNA濃度與純度，將重組質粒進行10倍梯度稀釋，以1×10²～1×10⁸拷貝數/微升作為標準品模板，用于熒光定量PCR反應條件的優化、標準曲線的建立，所用公式如下：

分子拷貝數(個/毫升)＝DNA質量濃度/DNA分子量

DNA分子量＝DNA堿基數×324.5

DNA質量濃度＝260納米吸光度×50微克/毫升×稀釋倍數×6.02×10²³；

6、熒光定量PCR反應標準曲線的建立：

分別以10倍拷貝系列稀釋的標準質粒DNA(1×10²～1×10⁸拷貝數/微升)為標準品模板進行熒光定量PCR擴增，每個稀釋度做兩個復孔，測定該方法的檢測靈敏度、分析實驗的重復性。

在上述步驟3和步驟5中PCR擴增的反應條件為：

(1)、94℃預變性5分鐘；

(2)、94℃變性15秒，50℃退火15秒，72℃延伸20秒，為一個循環，共進行30個循環；