[發(fā)明專利]一種用于Vero細胞微載體培養(yǎng)的無動物來源成分無血清培養(yǎng)基

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010164371.5
• 申請日: 2010-05-06
• 公開（公告）號: CN101864393A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發(fā)明（設計）人: 陳昭烈;劉紅;劉興茂;李世崇;葉玲玲;吳本傳;王啟偉
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京北新智誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11100
• 代理人: 程鳳儒

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及一種用于Vero細胞微載體培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，更具體地說是用于Vero細胞微載體固定化培養(yǎng)的無動物來源成分無血清培養(yǎng)基，屬于細胞工程技術(shù)領域。

背景技術(shù)

Vero細胞(African?green?kidney?cell，Vero?cell)是世界衛(wèi)生組織和我國生物制品規(guī)程贊同的疫苗生產(chǎn)細胞系，是現(xiàn)階段病毒疫苗生產(chǎn)的最主要細胞基質(zhì)。與用作疫苗生產(chǎn)的原代細胞、二倍體細胞和其它一些傳代細胞基質(zhì)相比，Vero細胞具有以下特點：①來源方便，可連續(xù)傳代，生長速度快；②對多種病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高；③遺傳性狀穩(wěn)定，惡性轉(zhuǎn)化程度低，生物安全性較高；④培養(yǎng)條件要求不苛刻，易于在生物反應器實施大規(guī)模培養(yǎng)。

Vero細胞的貼附依賴生長特性，決定了其需要在適宜的介質(zhì)表面貼附、鋪展為前提的貼壁培養(yǎng)(anchorage-dependent?culture)模式。Vero細胞貼壁培養(yǎng)的最經(jīng)典和簡便方法是以組織培養(yǎng)瓶(T-flask)和轉(zhuǎn)瓶(roller?bottle)的內(nèi)表面為介質(zhì)貼附生長。這些培養(yǎng)體系所能提供的細胞生長面積有限，細胞培養(yǎng)規(guī)模的放大只能依賴培養(yǎng)單元的增加，由此給疫苗生產(chǎn)帶來諸如污染風險大、生產(chǎn)效率低、產(chǎn)品質(zhì)量可控性差以及人力資源需求大等弊端。微載體培養(yǎng)(microcarrier?culture)是融合懸浮培養(yǎng)優(yōu)點的一種特化的細胞貼壁培養(yǎng)模式。其基本特征是細胞貼附于微載體表面并隨其共同懸浮于培養(yǎng)基中生長。微載體的應用不僅大大增加了單位培養(yǎng)體積中細胞賴以生長的表面積，同時也加大了細胞培養(yǎng)過程監(jiān)測和控制以及細胞培養(yǎng)規(guī)模放大的可實施程度。

疫苗的接種對象主要是針對大范圍的健康人群，其質(zhì)量和安全性一直是備受關注的首要問題。疫苗的質(zhì)量和安全性在很大程度上取決于疫苗的生產(chǎn)方式和過程。血清是一種組份復雜而尚不完全明確的混合物，其中，至少含有1000種不同蛋白質(zhì)，總蛋白量高達60-150g/L。它能為細胞的體外培養(yǎng)提供必要的生長因子、激素、細胞貼附因子和營養(yǎng)成分。受Vero細胞自身的貼附依賴生長特性和動物細胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展進程的影響，本世紀之前的Vero細胞培養(yǎng)及病毒疫苗生產(chǎn)均存在著對血清的依賴。血清組分的復雜性和不確定性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潛在風險，影響著病毒疫苗的生產(chǎn)工藝和疫苗質(zhì)量。從病毒疫苗生產(chǎn)工藝角度的考慮，血清組分的復雜性和批次間的質(zhì)量差異增加了病毒疫苗生產(chǎn)的不穩(wěn)定性和產(chǎn)品質(zhì)量控制的難度；從病毒疫苗的安全性考慮，血清中潛在的病原微生物，如引起牛海綿狀腦炎(bovine?spongiform?encephalopathy)的朊病毒，給疫苗的使用帶來了不容忽視的安全隱患。

由血清使用所造成的細胞培養(yǎng)過程和細胞表達產(chǎn)物安全性的不確定因素增加的現(xiàn)實問題，成為動物細胞無血清培養(yǎng)技術(shù)研究和應用的發(fā)展動因。隨著動物細胞無血清培養(yǎng)技術(shù)的不斷進步，為包括Vero細胞在內(nèi)的動物細胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)技術(shù)的應用提供了必要的技術(shù)支撐，無血清培養(yǎng)已成為包括疫苗在內(nèi)的生物技術(shù)藥物生產(chǎn)的總趨勢。美國、歐盟和日本等發(fā)達國家將于2010年全面停止在生物制藥中應用血清，F(xiàn)DA將停止含血清細胞培養(yǎng)工藝生產(chǎn)的生物技術(shù)新藥的申報受理。

培養(yǎng)基是影響體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)、生長、代謝、增殖乃至生存的最直接和最重要的環(huán)境因素。由于Vero細胞的培養(yǎng)需要在適宜的介質(zhì)表面貼附、鋪展才開始有絲分裂、增殖，病毒的有效感染和增殖也有賴于細胞的貼附生長狀態(tài)，適用于Vero細胞微載體培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基應能有效地支持細胞在微載體表面的貼附、鋪展。由此，不僅提高了Vero細胞無血清培養(yǎng)基配方成分的復雜程度，也加大了Vero細胞無血清培養(yǎng)基的成本控制壓力。

文獻報道的Vero細胞無血清培養(yǎng)基包含牛血清白蛋白(bovine?serum?albumin，BSA)、動物明膠(膠原)等動物來源的添加成分。含BSA、動物明膠(膠原)等動物來源添加成分的無血清培養(yǎng)基在很大程度上遺留著動物來源血清在動物細胞培養(yǎng)的應用中可能產(chǎn)生的上述問題。

盡管國外已有多種商品化的Vero細胞無血清培養(yǎng)基上市，如美國Invitrogen公司的VP-SFM和OptiPro?SFM、AXCELL?Biotechnologies公司的MDSS2、JRH公司的EX-CELL^TMVERO等。但商品化的Vero細胞無血清培養(yǎng)基不同程度存在諸如培養(yǎng)基大多以液體的形式提供、價格昂貴、培養(yǎng)基的成分配方秘而不宣、細胞由含血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)存在適應過程等問題。

發(fā)明內(nèi)容