[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)天麻多糖中單糖組成的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010157658.5
• 申請(qǐng)日: 2010-04-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101825611A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧平華;侯峰;錢(qián)陳欽
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣州市和藤醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/02
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/02
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及多糖組分分析領(lǐng)域。具體涉及一種檢測(cè)天麻多糖中單糖組成的方法。

背景技術(shù)

天麻(Gastrodia?elata?Blume)屬蘭科非自養(yǎng)型植物的干燥塊莖，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥，天麻具有平肝熄風(fēng)止痙之功效，主要用于治療治療頭痛眩暈、驚風(fēng)抽搐、肢體麻木、面肌痙攣、高血壓、冠心病等疾病。早期的研究者提取分離出天麻中許多活性成分，包括天麻素、天麻苷元、派立新、香草醇、對(duì)羥基苯甲醛、甾醇、檸檬酸、琥珀酸等。近年來(lái)，許多研究工作者都從天麻中分離得到了天麻多糖，并對(duì)其藥理活性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明，天麻多糖具有清除自由基、抗眩暈、降血壓，增強(qiáng)免疫，抑菌等功效。

多糖是由多個(gè)單糖分子縮合、失水而成，是一類(lèi)分子機(jī)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類(lèi)物質(zhì)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，多糖及其綴合物作為支持組織和能量來(lái)源的傳統(tǒng)觀念早已被突破，而被認(rèn)為是生物體內(nèi)除核酸以外的又一類(lèi)重要的信息分子，而且由于它們常是細(xì)胞表面信號(hào)識(shí)別、抗原抗體反應(yīng)、細(xì)胞間信息的傳遞和感受的關(guān)鍵因子，因此，具有生物活性的活性多糖的研究日益受到重視。

多糖的生物活性與其平均分子質(zhì)量大小和單糖組成有密切的關(guān)系，所以檢測(cè)多糖中單糖的組成對(duì)多糖生物活性的研究有很大的幫助。

用于多糖測(cè)定的方法主要有顯色法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、陰離子色譜法，C18柱HPLC-UV法等。其中顯色法只能檢測(cè)總多糖含量，專(zhuān)屬性差。氣相色譜法過(guò)程復(fù)雜而且會(huì)出現(xiàn)異構(gòu)化色譜峰。毛細(xì)管電泳法存在靈敏度差的缺點(diǎn)。陰離子色譜法所用柱子價(jià)格昂貴，且需要很長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)平衡。C18柱HPLC-UV法對(duì)植物多糖中單糖組分的檢測(cè)具有檢測(cè)設(shè)備相對(duì)便宜，靈敏度高，準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，被越來(lái)越多的多糖研究人員采用。

目前，天麻多糖的檢測(cè)主要用到上述的顯色法和陰離子色譜法，未見(jiàn)天麻多糖中單糖檢測(cè)用到C18柱HPLC-UV法的研究報(bào)道。由于干擾成分和單糖組成的不同，在直接使用文獻(xiàn)中報(bào)道的其他多糖C18柱HPLC-UV法檢測(cè)時(shí)，總會(huì)出現(xiàn)各種各樣的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種方便、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的檢測(cè)天麻多糖中單糖組成的方法。

本發(fā)明針對(duì)天麻多糖檢測(cè)過(guò)程中干擾成分和組成單糖的不同，在現(xiàn)有C18柱HPLC-UV法檢測(cè)其他植物多糖的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展和改進(jìn)，形成了一種新的方法用于天麻多糖中單糖組成的檢測(cè)。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案為：

從天麻中提取制得的天麻多糖，先通過(guò)酸水解使其成為單糖，然后加入衍生化化試劑進(jìn)行衍生化，衍生化完成后，進(jìn)入HPLC系統(tǒng)檢測(cè)。在HPLC系統(tǒng)中，使用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱進(jìn)行分離，柱溫35℃，流動(dòng)相是按一定比例混合的緩沖鹽和有機(jī)溶劑，流速0.8～1.5ml/min，紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)220～360nm。

在本發(fā)明中，天麻多糖首先加酸水解形成單糖，所用酸選自無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸，包括但不限于鹽酸、硫酸、甲酸、乙酸、三氯乙酸和三氟乙酸等。水解物用衍生化試劑進(jìn)行衍生化，所用衍生化試劑包括但不限于1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)。

在HPLC系統(tǒng)中，使用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，柱子內(nèi)徑、顆粒粒徑和柱子長(zhǎng)度可任意選擇，只要能分離開(kāi)各個(gè)單糖即可。流動(dòng)相為緩沖溶液和有機(jī)溶劑的混合液，所用緩沖溶液是弱酸與其鹽的混合溶液，包括但不限于磷酸二氫鉀水溶液-氫氧化鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、醋酸-醋酸鈉水溶液、醋酸銨水溶液-醋酸、檸檬酸-檸檬酸鈉水溶液等，所用有機(jī)溶劑包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈等。流速在0.8～1.5ml/min范圍內(nèi)任意選擇。紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)在220～360nm間任意選擇。

使用本發(fā)明所述方法，可一次性分離檢測(cè)出天麻多糖中各個(gè)單糖含量，方法的專(zhuān)屬性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確性好。所使用的儀器設(shè)備比較常見(jiàn)，方法容易實(shí)現(xiàn)，檢測(cè)成分較低。

附圖說(shuō)明：

圖1天麻多糖HPLC檢測(cè)色譜圖

具體實(shí)施方式：

實(shí)施一

1.儀器與試藥

1.1儀器

Ultimate?3000高效液相色譜儀(美國(guó)戴安公司)；水浴鍋BC-W203(上海貝凱)；XS105電子天平(Mettler-Tolledo)

1.2試藥

超純水，娃哈哈純凈水；甲醇、乙腈均為色譜純迪馬公司；氯仿、甲醇、濃硫酸、葡萄糖、NaOH、鹽酸、冰醋酸、乙酸銨均為分析純廣州試劑廠；甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖均為分析純上海試劑二廠；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)分析純天津大茂。

2.色譜條件