[發明專利]可用于高通量全自動化提取的磁珠法病毒核酸提取方法

有效

• 申請號: 201010157542.1
• 申請日: 2010-04-28
• 公開（公告）號: CN101851617A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發明（設計）人: 王剛;王延旭;戴潔;董濤;王凌云;吳曉明
• 申請（專利權）人: 長春市博坤生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 余巖

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其是涉及一種可用于高通量全自動化提取的磁珠法病毒核酸提取方法。

背景技術

隨著分子生物學的飛速發展，PCR和RT-PCR已經成為DNA病毒和RNA病毒高靈敏度檢測的強有力工具。PCR和RT-PCR方法與當前的其他檢測技術相比，不管是檢測靈敏度，特異性還是花費時間方面都有了長足的進步，而且，由于Genbank數據庫中收錄了大量的病毒核酸序列，這對病毒特異的PCR引物設計提供了得天獨厚的優勢。隨著PCR和RT-PCR在病毒檢測中的應用越來越廣泛，病毒核酸提取的工作量飛速增加，傳統的手工操作已經不能滿足疾控、血液供給篩查等領域高通量篩查的要求，采用自動化提取設備進行病毒核酸高通量自動化提取已經成為大勢所趨。

傳統的病毒核酸提取技術是：首先制備大量的病毒(如感染病毒的細胞)，然后破壞或者裂解病毒，釋放病毒核酸進入溶液環境，然后將核酸與(病毒外殼)蛋白分離，利用有機溶劑如苯酚或氯仿抽提等方法去除蛋白質，純化其中的核酸。此過程為手工操作，步驟繁瑣、低效而且有毒不環保。

近年來，市場上也涌現了各種各樣比傳統技術簡單方便的病毒核酸提取技術。主流技術主要有兩類：基于離心柱法的病毒核酸提取技術和基于磁珠法的病毒核酸提取技術。基于離心柱法的提取技術由于與離心柱配套使用的高通量自動化離心設備成本過高，因此雖然可以實現自動化操作，但是難以普及推廣，仍以手工操作為主?；诖胖榉ǖ牟《竞怂崽崛〖夹g采用具有超順磁性的磁性材料(簡稱磁珠)，利用基于簡單的磁分離裝置的自動化提取設備即可實現病毒核酸提取的高通量自動化操作，已經成為當前病毒核酸高通量自動化提取的主流技術。但目前用于提取病毒核酸的磁珠法病毒核酸提取技術都只適用于從宿主體系已經分離出來的病毒?，F有的磁珠法病毒核酸提取技術中均只用到一種可用于核酸分離的磁珠，在進行病毒核酸提取前，需要對生物樣品進行前處理，把病毒分離出來，然后再用可分離核酸的磁珠對分離得到的病毒進行核酸提取。常用的分離病毒的方法是先裂解細胞，然后用中性鹽或聚乙二醇等試劑將病毒沉淀，再離心得到病毒；或者裂解細胞后，用羥基磷灰石等凝膠吸附病毒，再改變緩沖液條件把病毒洗脫下來。無論是沉淀離心還是凝膠吸附，都涉及復雜設備(離心機或層析設備)，這一過程很難與磁珠法病毒核酸提取技術中基于磁分離的自動化提取操作整合在一起，仍需手工操作。目前也有采用抗體包覆的磁珠分離病毒的技術，但是其后續的核酸提取并未采取磁分離法。同時針對不同類病毒需要包覆不同的抗體，該技術不具有通用性。因此目前報道的磁珠法病毒核酸提取技術均無法實現具有通用性的從病毒提取到病毒核酸提取整個過程的高通量全自動化操作。

發明內容

本發明的目的就是克服現有技術的不足，提供一種可用于高通量全自動化提取的磁珠法病毒核酸提取方法。

為實現上述目的，本發明提供一種可用于高通量全自動化提取的磁珠法病毒核酸提取方法，其特征在于包括下列步驟：

1、先用磁珠I分離病毒：從生物樣品中將病毒吸附到磁珠I上，得到吸附有病毒的磁珠I，簡稱病毒-磁珠I復合物，外加磁場將病毒-磁珠I復合物與樣品分開，將病毒-磁珠I復合物懸浮于裂解液I中，在裂解液I中病毒從磁珠I上解離，外加磁場除去磁珠I，加熱使病毒裂解；

2、再用磁珠II分離病毒核酸：用磁珠II吸附病毒裂解物中的病毒核酸，外加磁場將吸附有病毒核酸的磁珠II與病毒裂解物分開，用洗滌液洗滌吸附有病毒核酸的磁珠II后，用溶解液將病毒核酸從磁珠II上洗脫下來得到純化的病毒核酸。

所述磁珠I具有可吸附病毒的特征，它包含兩個部分，一部分是可吸附病毒的凝膠；另一部分為具有超順磁性的磁性納米粒子Fe、Co、Ni、Fe₂O₃、Fe₃O₄、Co₂O₃、Co₃O₄中一種或兩種以上的混合物。

所述可吸附病毒的凝膠為羥基磷灰石凝膠或焦磷酸鎂凝膠。

本發明中使用的磁性納米粒子可購買商品化的成品，也可利用文獻公開報道的方法直接合成。