[發明專利]一種適用于宮頸組織micro RNA實時熒光定量PCR研究的新內參分子的篩選方法

無效

• 申請號: 201010155872.7
• 申請日: 2010-04-26
• 公開（公告）號: CN101818202A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發明（設計）人: 謝幸;沈源明;呂衛國;葉楓;李陽;王芬芬;萬小云
• 申請（專利權）人: 浙江大學醫學院附屬婦產科醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64;G06F19/00
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
• 代理人: 王曉峰

技術領域

本發明涉及一種適用于宮頸組織micro?RNA實時熒光定量PCR研究的新內參分子的篩選方法。

背景技術

宮頸癌是發病率僅次于乳腺癌的女性第二大的惡性腫瘤，大量的流行病學資料表明，高危人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌及其癌前病變發病的必要條件，但是單一HPV感染并不足以引起宮頸上皮的惡性轉化。微小RNA(micro?RNA，簡稱miRNA)是生物體內源長度約為20-23個核苷酸的非編碼小RNA，通過與靶mRNA的互補配對而在轉錄后水平上對基因的表達進行負調控，導致mRNA的降解或翻譯抑制。到目前為止，已報道有幾千種miRNA存在于動物、植物、真菌等多細胞真核生物中，進化上高度保守。

許多研究證明，miRNA可以用以標記癌癥，例如，美國俄亥俄州立大學的研究通過分析來自肺部、宮頸、胃部、前列腺、結腸和胰腺等處的癌細胞樣品540份，發現了由過量表達的大部分miRNA組成的實體癌癥miRNA信號。而對于編碼蛋白的腫瘤抑制子和致癌基因，這些miRNA差異表達作用的靶目標會大量富集，這說明miRNA在實體腫瘤的癌癥發病機理中發揮著重要的作用。提示其極有可能在HPV致宮頸癌的發生發展過程中發揮關鍵作用。近年來的研究已發現若干MicroRNA在宮頸癌中表達異常，因此利用實驗生物學及生物信息學方法對與宮頸癌相關的MicroRNA進行研究是當前研究的熱點之一。

要了解MicroRNA在基因調控中扮演的角色，很關鍵的一個方法就是迅速、準確地定量檢測MicroRNA基因的表達。成熟的MicroRNA一般只有二十幾個堿基，同族的MicroRNA之間通常只有一兩個堿基的差別，而且絕大部分MicroRNA在細胞中的表達水平都比較低，這些特性給傳統的印跡雜交(northern?blot)，生物芯片技術(microarray)和RT-PCR等常規手段帶來了極大的困難和挑戰。隨著PolyA?RT-PCR技術、尤其是stem-loopRT-PCR技術的發展，實時熒光定量PCR(real-time?PCR)已經成為目前MicroRNA定量檢測的主要方法，該法不僅靈敏度高，樣品消耗量少，能檢測出低豐度靶MicroRNA，定量線性范圍寬；而且可精確區分同一家族中序列高度同源的MicroRNA，能精確檢測只有一個堿基差別的不同micro?RNA的表達水平。但是實時熒光定量PCR檢測的準確性很大程度上依賴于篩選適合的內參基因對數據進行校正和標準化，從而避免不同標本在RNA的產量、質量及逆轉錄效率上可能存在的差別。

以往對mRNA的研究證實，任何一種內參基因的所謂恒定表達都只是在一定類型的細胞或實驗因素作用下有范圍的恒定。在其他類型的細胞中或實驗因素作用下則是變化的，盲目地使用內參基因，一方面可能使基因表達的微小差異難以發現，另一方面可能引致錯誤甚至相反的結論。MicroRNA在細胞中的表達水平低僅占總RNA的0.01％，且其表達具有更大的組織特異性，所以選擇合適的內參對目的MicroRNA的表達進行標準化就顯得尤為重要。目前文獻中用來作為MicroRNA?QRT-PCR內參的分子主要有let-7a，MicroRNA-103a，MicroRNA-16，MicroRNA-191、MicroRNA-26b等和小分子RNA(RNU48、5S)，因所研究組織的不同其選擇內參也不同。

到目前為止，對宮頸病變相關的特異性micro?RNA的定量研究中多盲目的參照在其他腫瘤中使用過的內參分子(RNU48、5S、let-7a)，但對其在宮頸組織中表達的恒定性及其作為內參的適用性均未進行探究。

發明內容

本發明的發明目的，在于針對現有宮頸組織中特異性MicroRNA的定量研究中內參使用的研究效果上的缺陷，提出了一種適用于宮頸組織micro?RNA實時熒光定量PCR研究的新內參分子的篩選方法；運用本發明方法篩選并證實的內參分子，可避免不同宮頸組織標本在RNA的產量、質量及逆轉錄效率上可能存在的差別，更好的對實時熒光定量PCR檢測的數據進行校正和標準化，提高研究的準確性及可靠性。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案是：

一種適用于宮頸組織micro?RNA實時熒光定量PCR研究的新內參分子的篩選方法，其步驟為：

(1)利用MicroRNA芯片對人類MicroRNA探針進行篩選，選出在宮頸癌及宮頸正常組織表達恒定且表達豐度高的MicroRNA，作為候選的內參；

(2)分別選取正常宮頸上皮組織和癌變宮頸組織作為臨床宮頸組織標本，用熒光定量PCR進行驗證；