[發明專利]一種紅細胞吸附法聯合RT-PCR檢測具有血凝性病毒的方法

無效

• 申請號: 201010154786.4
• 申請日: 2010-04-23
• 公開（公告）號: CN102234692A
• 公開（公告）日: 2011-11-09
• 發明（設計）人: 易建中;劉成倩
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 費開逵

技術領域

本發明涉及一種紅細胞吸附法聯合RT-PCR檢測具有血凝性病毒的方法，具體涉及一種以新城疫為研究對象，采用紅細胞吸附法聯合RT-PCT檢測具有血凝性病毒的方法。

背景技術

有些病毒能吸附于雞、火雞和鴨等動物的紅細胞表面，并引起紅細胞凝集，這種特性與病毒囊膜上的纖突所含血凝素和神經氨酸酶有關。具有這種特性的病毒主要有新城疫和禽流感等。

新城疫(Newcastle?Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle?disease?virus，NDV)引起的一種極易傳染的毀滅性疾病，典型癥狀是呼吸道、消化道黏膜出血，最常侵襲家雞，也能感染許多其它家禽和野鳥，人也有易感性。該病1926年首次發現于印尼，同年發現于英國新城，因此得名新城疫。該病分布于世界各地，1928年我國已有該病的記載，1935年在我國有些地區流行。新城疫感染的死亡率高達100％，同高致病性禽流感同屬A類病，給世界養禽業帶來巨大的威脅。目前用于檢測NDV的方法有血凝和血凝抑制試驗、酶聯免疫吸附試驗、病毒分離法等，這些方法雖然可以對病原作出診斷，但卻存在費時、代價高、敏感性和穩定性不夠好的缺點。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種紅細胞吸附法聯合RT-PCR檢測具有血凝性病毒的方法。以新城疫病毒(NDV)作為研究對象，選取NDV的核衣殼蛋白的核苷酸序列設計一對引物，利用其能吸附于雞、火雞和鴨等動物的紅細胞表面這一重要生物學特性，建立一種適合于NDV快速檢測的紅細胞吸附聯合RT-PCR法。本發明方法敏感性和穩定性都很好，具有較大的臨床運用價值，也同樣適合于禽流感等具有血凝性病毒的檢測。

本發明的紅細胞吸附法聯合RT-PCR檢測具有血凝性病毒的方法，具體包括以下步驟：

1)制備紅細胞

用滅菌注射器吸取檸檬酸抗凝劑1mL(其用量為所需血量的1/4體積)，從雞翅靜脈抽血4mL，置滅菌離心管內，加滅菌PBS10mL，以2000r/min離心5min，棄上清液，再加滅菌PBS?10mL懸浮血球，再以2000r/min離心5min，如此將紅細胞洗滌三次即可。

2)紅細胞吸附NDV

取出從雞場采集的污染糞便0.1g，加2mLPBS振蕩混勻，使病毒溶解于PBS中，以10000r/min離心5min，取離心后上清液加約50uL的紅細胞，室溫作用1小時，2000r/min離心5min，棄上清，沉淀即為含有NDV的紅細胞。如果污染的病料中含極少NDV，可通過紅血球多次吸附以集中NDV。

3)病毒RNA提取

RNA提取按Trizol-A⁺提取總RNA說明書進行。

4)RT-PCR擴增

i)引物設計與合成

根據GenBank上已公布的NDV-NP基因序列，設計合成了一對特異性引物，能擴增578bp的基因片段。引物序列如下：

NP-F1：5′TATTCTGTCTTCGGATTGCT?3′

NP-R1：5′GCTCCCACCTGCTGTATT?3′

以上引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

ii)反轉錄

冰上操作，在PCR管中依次加入焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水6μL，5×反轉錄酶Buffer?4μL，dNTP?Mixture(10mM)1μL，NP上游引物F11μL(10μM)，RNA酶抑制劑1μL，NDV病毒RNA?5μL，AMV反轉錄酶2μL(5U/μL)，總體積20μL。在冰上混合后，室溫放置10min，42℃1h后冰上冷卻2～3min；所得的反應液可立刻用于PCR反應或-20℃保存備用。

iii)PCR反應

在PCR管中依次加入反轉錄產物2μL，10×Buffer(Mg²⁺free)2.5μL，MgSO₄2μL，dNTP(10mM)1μL，NP-F1、NP-R1(10μM)各1μL，Taq?DNA聚合酶(5U/μL)0.25μL，ddH₂O?15.25μL；總體積25μL在冰上混合。

PCR反應條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，49℃退火25s，72℃延伸60s，循環32次，最后72℃延伸10min。

5)敏感性試驗