[發(fā)明專利]一種高效介導(dǎo)DC基因轉(zhuǎn)移的重組腺病毒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010154620.2
• 申請日: 2010-04-26
• 公開（公告）號: CN102002513A
• 公開（公告）日: 2011-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王立生;王華;魯茁壯;楊月峰;胡澤斌;吳祖澤
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N7/01;A61K48/00;A61P35/00
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和基因治療領(lǐng)域，具體為一種高效介導(dǎo)DC基因轉(zhuǎn)移的重組腺病毒。

背景技術(shù)

自1973年Steinman和Cohn首次報道樹突狀細(xì)胞(Dendritic?cell，DC)以來，人們對DC的認(rèn)識不斷深入。目前認(rèn)為DC是人體內(nèi)最重要，抗原遞呈能力最強，體內(nèi)唯一能活化靜息T淋巴細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞，是機體免疫應(yīng)答的始動者，它具有攝取、加工抗原，以主要組織相容性復(fù)合物(MHC)I、II類肽復(fù)合物的形式遞呈抗原，促進T、B淋巴細(xì)胞增殖的能力，在天然免疫和獲得性免疫中都發(fā)揮著極其重要的作用。

研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與患者體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞功能缺陷有關(guān)，特別是晚期腫瘤患者，其體內(nèi)往往存在體液免疫和細(xì)胞免疫功能的普遍低下，且其低下程度與其臨床分期密切相關(guān)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致免疫功能低下的根本原因在于機體對成熟DC的功能下調(diào)。體外實驗證實即使由晚期腫瘤患者體內(nèi)分離出的淋巴細(xì)胞對多種外界刺激仍然保持著很好的反應(yīng)能力。因此，通過體外培養(yǎng)DC，制備DC瘤苗免疫荷瘤宿主，有望成為腫瘤的理想療法。

基因修飾免疫細(xì)胞是目前腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點之一，其具體策略是通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將目的基因?qū)朊庖呒?xì)胞，然后將表達(dá)目的基因的免疫細(xì)胞輸入患者體內(nèi)，從而提高免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的識別或殺傷能力。基因修飾DC介導(dǎo)的腫瘤治療成為當(dāng)今腫瘤生物治療領(lǐng)域中備受關(guān)注的焦點之一。

有效的基因治療依賴于外源基因高效、穩(wěn)定的表達(dá)。腫瘤抗原基因?qū)隓C的方法一般有兩大類：一是以腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘病毒和腺病毒相關(guān)病毒等為載體的病毒載體方法；二是DNA脂質(zhì)體復(fù)合物、磷酸鈣沉淀、電穿孔等非病毒載體方法。非病毒載體方法轉(zhuǎn)染的優(yōu)勢在于：插入片段大小不受限制；免疫原性低；生產(chǎn)簡便。其缺點是外源基因的轉(zhuǎn)染效率一般很低。病毒載體介導(dǎo)方法，以其高轉(zhuǎn)染率和良好的靶向性成為腫瘤基因治療中應(yīng)用最廣泛的方法。利用病毒載體將帶有腫瘤抗原的編碼基因轉(zhuǎn)染DC制備的疫苗，由于可以在DC細(xì)胞內(nèi)加工和持續(xù)表達(dá)相應(yīng)特異性抗原，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答而備受關(guān)注。其中最常用的包括逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)和腺相關(guān)病毒(adeno-associated?virus，AAV)等載體。

逆轉(zhuǎn)錄病毒可將轉(zhuǎn)染的基因整合到染色體上，因此可以保證轉(zhuǎn)基因的長期表達(dá)，但這種整合是隨機的，可能導(dǎo)致細(xì)胞突變而誘發(fā)癌癥；逆轉(zhuǎn)錄病毒只感染分裂細(xì)胞；用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)染DC的效率只有10％～30％，因此，介導(dǎo)腫瘤基因治療存在一定的局限性。在法國進行逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體的人類基因治療臨床研究出現(xiàn)了誘發(fā)血液系統(tǒng)惡性腫瘤的嚴(yán)重問題。

腺病毒是眾多的病毒載體基因轉(zhuǎn)移方式中最常見的，其優(yōu)點在于：安全，有效；腺病毒可以通過上調(diào)DC細(xì)胞表面的MHC及共刺激分子表達(dá)來促進其成熟；插入的外源片段大小可達(dá)37kb；腺病毒轉(zhuǎn)染后的DC可以保持正常的表型特征和功能；體內(nèi)回輸在肝臟短暫停留后移行到脾臟并持續(xù)表達(dá)外源基因，血清中不產(chǎn)生抗Ad抗體。美國Genzyme公司和麻省總醫(yī)院MGH的學(xué)者也探索了腺病毒介導(dǎo)的gp100基因轉(zhuǎn)染的小鼠骨髓來源DC的性質(zhì)，并通過小鼠體內(nèi)實驗證明gp100基因修飾的DC體內(nèi)免疫后可誘導(dǎo)出gp100特異性CTL。國內(nèi)章衛(wèi)平等也報道了腺病毒介導(dǎo)的GM-CSF基因修飾的DC與腫瘤細(xì)胞的融合疫苗體內(nèi)免疫激活效果的研究結(jié)果。

腺病毒進入細(xì)胞主要由纖維頂球與細(xì)胞表面受體的相互作用所介導(dǎo)，所以傳統(tǒng)的5型腺病毒對DC的感染效率比較低。因此，對其親嗜性的修飾對于基于DC的基因治療的發(fā)展無疑起著重要作用。AdEasy腺病毒制備系統(tǒng)是實驗室普遍使用的腺病毒包裝系統(tǒng)，我們基于此系統(tǒng)對5型腺病毒纖維基因進行修飾，將AdEasy-1載體中5型腺病毒的纖維頂球和柄部替換為11p型腺病毒的相應(yīng)部分。通過這種方法改構(gòu)腺病毒，不僅可以提高重組腺病毒對DC的感染效率，而且還可以實現(xiàn)纖維基因與目的基因在不同的載體同時進行操作。

綜上所述，制備一種能夠高效感染DC的重組腺病毒，為腫瘤的基因治療提供一種特異、高效的方法，具有重大的理論和現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是在于建立一種能夠高效介導(dǎo)DC基因轉(zhuǎn)移的腺病毒制備體系，為基于DC的靶向基因治療提供一種新的策略。