[發明專利]淋巴結靶向轉移性人肝癌細胞株及其建立方法

有效

• 申請號: 201010153268.0
• 申請日: 2010-04-22
• 公開（公告）號: CN101831404A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 吳偉忠;陶中華;李薇薇;孫惠川;湯釗猷;樊嘉;欽倫秀;王魯
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬中山醫院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12R1/91
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩

技術領域

本發明涉及淋巴結靶向轉移性人肝癌細胞株及其建立方法，具體涉及及能穩定表達紅色熒光蛋白(RFP)、具淋巴結靶向轉移能力的人肝癌細胞株HCCLM3-R-LnM1及其建立方法，屬于微生物動物細胞系技術領域。

背景技術

原發性肝細胞癌是我國乃至全球的高發惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率均位列惡性腫瘤第二位。臨床上有多種方法治療肝癌，如手術切除、TACE、瘤內酒精注射、射頻治療和放射治療等，但長期療效有限。根據復旦大學肝癌研究所對9,800多例肝癌手術患者的臨床長期隨訪資料統計發現，肝癌患者手術后5年的生存率仍低于50％，其主要死亡原因為肝癌的復發與轉移。

臨床上肝癌患者常出現淋巴結和肺臟轉移。目前國內外缺乏相應的研究對象，對肝癌細胞的器官靶向性轉移分子機理知之甚少，也缺乏必要的干預手段。為此，復旦大學肝癌研究所在世界上率先建立了具有自主知識產權和國家專利的裸鼠人肝癌轉移模型(LCI-D20)(Sun?FX，et?al.Int?J?Cancer.1996；66：239-243.)，克隆到了具有高轉移潛能的人肝癌細胞系(MHCC97)(Tian?J，et?al.Br?J?Cancer.1999；81：814-821.)，篩選出了具有相同遺傳背景的、不同轉移潛能的系列肝癌細胞株(MHCC97-H，MHCC97-L)(Li?Y，et?al.World?J?Gastroenterol.2001；7：630-636.專利號WO?2003/087766?A3，ZL2003?1?0122611.5)和高轉移特性的人肝細胞癌細胞系HCCLM3和HCCLM6(J?Cancer?ResClin?Oncol.2004；130：187-196；J?Cancer?Res?Clin?Oncol.2004；130：460-468；中華醫學雜志.2004；84：675-679；Cancer?Genet?Cytogenet.2005；158：180-183；和ClinCancer?Res.2006；12：7140-7148)，并進一步發展了RFP和GFP熒光標記的肝癌細胞(HCCLM3RFP/GFP，HCCLM6RFP/GFP)和相應的熒光可視肝癌轉移模型(Yang?BW，et?al.EurJ?Gastroenterol?Hepatol.2008；20-1077-1084.專利申請號：200710045676.2；和200710045675.8)。國內外文獻中均未見到關于能穩定表達熒光的淋巴結靶向轉移性人肝癌細胞株的報道。

發明內容

本發明的目的是提供穩定表達熒光的淋巴結靶向轉移性人肝癌細胞株及其建立方法，更具體的是建立染色體整合型、穩定表達紅色熒光蛋白編碼基因的、具淋巴結靶向轉移能力的人肝癌細胞系。

本發明以紅色熒光蛋白表達肝癌細胞HCCLM3-R為母細胞，采用裸鼠皮下和肝臟原位移植瘤模型自發性淋巴結轉移篩選，淋巴結轉移人肝癌細胞再進行體外克隆擴增純化的方法，建立了一種淋巴結靶向轉移性人肝癌細胞株(HCCLM3-R-LnM1)。已于2010年3月3日保藏，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號：3645，分類命名：淋巴結靶向轉移人肝癌細胞株(HCCLM3-R-LnM1)。

所述紅色熒光蛋白表達肝癌細胞HCCLM3-R參見中國專利200710045676.2。已于2010年3月3日保藏，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號：3643，分類命名：表達紅色熒光蛋白人肝癌細胞株(HCCLM3-R)。

所述裸鼠皮下及肝臟原位移植瘤模型參見中國專利200710045675.8。

本細胞株具有以下生物學特性：

1、與母細胞具有相同的遺傳背景，細胞呈多邊形上皮樣，貼壁生長，接觸性生長抑制喪失，亞三倍體核型，染色體數目50-58條，均分泌AFP蛋白；

2、可穩定表達高強度紅色熒光：轉染的紅色熒光蛋白編碼基因與中國專利200710045676.2中所述具有序列1的紅色熒光蛋白RFP相同，經過基因改造，能夠有效延緩熒光淬滅時間，增加熒光表達強度，在激發波長為560nm、發射波長為585nm的條件下，可用熒光顯微鏡進行觀察；

3、遺傳性狀穩定、可在常規條件下連續傳代。