[發明專利]液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法

無效

• 申請號: 201010153203.6
• 申請日: 2010-04-16
• 公開（公告）號: CN101830979A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 沈靜茹;雷灼霖;劉波
• 申請（專利權）人: 中南民族大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/14
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 唐正玉

技術領域

本發明涉及一種用液-固萃取體系從血液中分離純化血清白蛋白的方法，更具體地說是涉及用液-固萃取體系從人血漿或牛血漿中純化血清白蛋白的方法。更具體地說，是通過分子識別機理，用聚乙二醇(PEG)二元脂肪酸修飾物混合聚合物-鹽-水液-固親和萃取法從血液中提取血清白蛋白。

背景技術

血清白蛋白是一種水溶性很強的蛋白，結構穩定，能結合多種小分子，在醫學臨床及生物領域有著廣泛的應用。蛋白質的分離純化原理主要基于溶解度差異、電荷差異、分子大小、疏水作用、生物親和差異來達到分離的。作為生物分子，蛋白質的分離純化與其它化學產品的分離有很大的差異：通常完成一次產品的純化需要好幾種方法結合使用，一般分為：前處理、粗分離、細分離和結晶四個步驟。隨著人類對蛋白質認識的深入，分離純化方法也一直在改進，當今純化研究的重點在提高純度、回收率，降低成本、減少繁冗的操作時間和步驟。

目前，血清白蛋白的分離純化方法有很多種，各自都具有一定的特點，歸納起來主要有以下方法：

1、利用溶解度差異分離純化血清白蛋白

沉淀法是一種初級分離技術，但是，多步操作也可以獲得高純度的目標產品。

(1)鹽沉淀法

蛋白質在不同濃度的中性鹽溶液中溶解度有不同程度的降低，采用添加中性鹽的方法使各種蛋白質依次分別沉淀出來的方法，叫鹽析法，比如硫酸銨、利凡諾、辛酸鹽沉淀法。但是鹽析法可能產生蛋白質聚合體或蛋白質變性，影響藥用效果，自動化程度低、生產周期長、成本高、純化倍數低。因此，在目前的實際應用中受到一定的限制。

(2)有機溶劑沉淀法

向蛋白質溶液中加入乙醇等水溶性溶劑之后，水的活度降低，利用有機溶劑較低的介電常數來沉淀白蛋白。最常用的是冷乙醇沉淀法，即著名的Cohn法。雖然廣泛應用于工業生產，但乙醇沉淀法也有一些不足：乙醇是一種非特異性沉淀劑，盡管對人血清白蛋白HSA生產效果顯著，但產品純度不是很高；作為有機溶劑的乙醇還可能使蛋白質發生聚集變性或者二級構象改變；生產不易實現自動化，生產周期長；在非封閉式的環境中有機溶劑對工作人員危害也較大，同時也有可能由于環境不潔造成產品污染。

(3)聚乙二醇(PEG)沉淀法

PEG沉淀的條件溫和，可以避免蛋白質聚集或變性，而且沉淀完全，但大量PEG價格較貴，從白蛋白溶液中除去在工業生產上需較大成本。M.I.Jimenez等人將聚乙二醇和乙醇結合來純化血清白蛋白，分離迅速，并達到了實驗室中等分離規模。但又用到了有機溶劑乙醇。

2、利用電荷差異分離純化血清白蛋白

(1)離子交換色譜

這是迄今利用較廣泛的色譜技術，在純化中占了75％。因為它具有分辨率高，交換容量大以及明確的作用機理等特點。在白蛋白的分離純化上有很重要的作用。但色譜柱的再生、保存、使用步驟煩瑣，以及容易出現柱阻塞等問題，限制了它的進一步使用。

(2)電泳法

電泳分離的原理和操作形式多樣，經過幾十年的發展，成為分離純化，特別是鑒定蛋白質的有力工具，現在正向綜合方向發展。尹開吉等利用壓力驅動的毛細管等電聚焦分離牛血清白蛋白和血紅蛋白，得到了理想的分離結果，且操作簡單。K.A.Denton等用中性涂布的高效毛細管分離臨床用HSA，得到了八種組分峰。但是電泳法分離純化蛋白質的量很少，不屬制備范疇，無法滿足制備需求，且電泳過程中產生的熱量可能導致蛋白質變性，并且成本也很高。

3、利用分子大小差異

(1)凝膠層析法

這是20世紀60年代初發展起來的一種簡單有效的技術。利用凝膠分子篩對大小、形狀不同的蛋白進行分離。分子大小相差25％的樣品，通過單一的凝膠就可以完全分開。應用于提純蛋白質、激素、核酸等。同時還可以進行脫鹽、濃縮、脫色、去熱原。具有分離效果好、操作簡單方便、分離廣泛及不影響生物活性的特點。但是分辨率不高，分離操作較慢，對于質量差異不大的樣品難以達到很好的分離。此外，凝膠層析要求樣品黏度不宜太高。凝膠顆粒有時還有非特異性的吸附現象。

(2)離心法

離心法具有可以迅速將沉淀和上清液分開、應用范圍廣，成本低等特點，但無法獲得純度很高的產品。并且受樣品濃度影響，離心力過大常會導致樣品顆粒變性、聚集而失活。

4、利用特殊選擇性分離純化血清白蛋白

楊利等用IDA型固定化鎳離子金屬螯合親和膜色譜對HSA分離純化，產品經毛細管電泳分析，純度與Sigma公司的電泳純HSA相當，回收率可達85％以上。