[發(fā)明專利]一種酶法制備L-2-氨基丁酸的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010146920.6
• 申請日: 2010-04-15
• 公開（公告）號: CN101818178A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 祝俊;蘇金環(huán);曾聰明;陶軍華;文軍
• 申請（專利權(quán)）人: 尚科生物醫(yī)藥(上海)有限公司
• 主分類號: C12P13/04
• 分類號: C12P13/04
• 代理公司: 上海浦東良風(fēng)專利代理有限責任公司 31113
• 代理人: 張勁風(fēng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種酶法制備L-2-氨基丁酸的方法，具體地說，涉及一種以L-蘇氨酸為原料，用兩種酶結(jié)合反應(yīng)制備L-2-氨基丁酸的方法。

技術(shù)背景

2-氨基丁酸是抑制人體神經(jīng)信息傳遞的天然氨基酸，也是一種重要的化工原料和醫(yī)藥中間體，已廣泛應(yīng)用于藥物合成，例如左乙拉西坦的合成(WO?03014080，2003)。左乙拉西坦是一種新型抗癲癇藥，主要用于治療局限性及繼發(fā)性全身性癲癇，它的分子結(jié)構(gòu)如圖所示，其中藍色部分通常由L-2-氨基丁酸或S-2-氨基丁酰胺作為前體。

目前2-氨基丁酸的制備方法主要有化學(xué)法和生物法。化學(xué)法制備是比較經(jīng)典的方法，主要有化學(xué)法合成和化學(xué)法拆分，例如，奚強等(武漢工程大學(xué)學(xué)報，2007，29(4)：15-17)以正丁酸、溴和氨水為原料合成了了2-氨基丁酸；Soloshonok等在美國化學(xué)學(xué)會雜志(Journal?of?the?American?Chemical?Society，2009，131(21)：7208-7209)運用手性拆分試劑與消旋的氨基丁酸形成非對映異構(gòu)體進行拆分得到L-2-氨基丁酸。這些方法雖然操作簡單，但或者反應(yīng)條件苛刻，易生成副產(chǎn)物；或者需要昂貴的試劑，成本較高，同時大量有機溶劑的使用還會造成環(huán)境污染。

微生物發(fā)酵法是制備天然氨基酸的最傳統(tǒng)方法，例如，Toshihiro等(JP?2000279163，2000)利用高紅曲發(fā)酵制備2-氨基丁酸。微生物發(fā)酵法專屬性較強，條件溫和，環(huán)境污染少，但存在反應(yīng)產(chǎn)物成分復(fù)雜、分離繁瑣的缺點。

酶催化轉(zhuǎn)化是一種高選擇性反應(yīng)，不同種類的酶可作用于不同構(gòu)型和不同種類的特定底物，從而達到定向轉(zhuǎn)化的目的。目前酶法制備L-2-氨基丁酸主要有兩種，一種是以2-丁酮為原料，通過脫氫酶或者轉(zhuǎn)氨酶催化制備，例如，Shin等在生物技術(shù)通訊(Biotechnology?Letters，2009，31(10)：1595-1599)用轉(zhuǎn)氨酶制備L-2-氨基丁酸，Krix等在生物工程雜志(Journal?of?biotechnology?1997，53：29-39)用亮氨酸脫氫酶催化2-丁酮和氨基供體制備得到L-2-氨基丁酸；另一種是對消旋2-氨基丁酸進行酶法拆分，例如，焦慶才等(CN101538596A)先用醋酐乙酰化2-氨基丁酸，然后再用氨基酰化酶進行拆分。酶催化制備方法效率高，專一性強，是一種較為理想藥物中間體制備方法，但目前酶催化工藝能真正實現(xiàn)工業(yè)化的例子還不是很多，主要障礙還是目前的工藝收率偏低，成本較高，工藝條件也不適合工業(yè)放大，因此建立一個高效、低成本，且易于工業(yè)化大生產(chǎn)的酶催化制備工藝仍是值得探索的領(lǐng)域，在制藥工業(yè)上也有較好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種高效、低成本，且易于工業(yè)化大生產(chǎn)的酶催化制備L-2-氨基丁酸的方法，主要解決目前酶催化制備方法收率偏低，成本較高，工藝條件也不適合工業(yè)放大的技術(shù)問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種用酶法制備L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，采用L-蘇氨酸為起始原料，首先通過蘇氨酸脫氨酶使其轉(zhuǎn)化為2-酮丁酸，然后利用亮氨酸脫氫酶使2-酮丁酸轉(zhuǎn)化生成L-2-氨基丁酸，反應(yīng)中加入用于輔酶再生的甲酸脫氫酶。三種酶的加入總量為0.5～5g/L，底物L(fēng)-蘇氨酸的加入量為10～100g/L，緩沖液為pH值7.0～9.0磷酸鹽液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值所用的溶液為濃氨水，將反應(yīng)液pH值調(diào)節(jié)為8.0～8.5；反應(yīng)溫度為15～40℃，優(yōu)選的反應(yīng)溫度為25～37℃；反應(yīng)時間為3～48小時。所述的反應(yīng)為“一鍋煮”形式，即所有底物和酶同時加入開始反應(yīng)，中間無需分離提純。反應(yīng)式如下：

本發(fā)明所提供的酶法制備L-2-氨基丁酸的方法中，所使用的蘇氨酸脫氨酶來源于E.coli?K12，亮氨酸脫氫酶來源于球形芽孢桿菌(Bacillus?sphaericus?IFO?3525)，這兩個酶均通過E.coli克隆表達得到，可通過發(fā)酵大量制備，是相對易得和廉價的催化劑。所述的酶為經(jīng)細胞破碎、冷凍干燥得到的凍干粉粗酶制劑。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種利用微生物酶在溫和條件下制備L-2-氨基丁酸的方法。與其它方法相比，本方法不但具有反應(yīng)條件溫和、專一性強、便于定向控制等諸多優(yōu)點，而且以價格相對低廉的L-蘇氨酸為起始原料，以可大量生產(chǎn)的克隆表達蛋白為催化劑，以“一鍋煮”的反應(yīng)方式進行轉(zhuǎn)化，以結(jié)晶的方式進行產(chǎn)物分離，這些特點使整個工藝成本較低，有利于大批量地工業(yè)制備。用該方法制備L-2-氨基丁酸，所得產(chǎn)物的純度可達到98％以上，光學(xué)純度＞99％，適合在制藥工業(yè)上推廣應(yīng)用。