[發明專利]報告基因小鼠T細胞體外培養分化模型及藥物篩選方法的建立

無效

• 申請號: 201010138847.8
• 申請日: 2010-04-06
• 公開（公告）號: CN101851657A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發明（設計）人: 尹芝南;劉蘭珍;溫倜;陳曦;趙立青;王璞玥;張寶童
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N15/10
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

【技術領域】：本發明涉及免疫學中T細胞培養分化和藥物篩選技術領域，更具體地，本發明涉及熒光報告基因小鼠T細胞體外培養分化模型及其藥物篩選平臺的建立方法，以及利用該方法篩選治療哮喘病的藥物。

【背景技術】：初始CD4⁺T細胞在不同的因子誘導下，分化成為功能及表型不同的效應性Th細胞和調節性T細胞(Treg)，并表達特定的細胞因子執行其功能：在IL-12和anti-IL4作用下向Th1分化，產生IFN-γ等，誘導細胞介導的免疫反應；在IL-4和anti-IFN-γ作用下向Th2分化，產生IL-4等，誘導細胞介導的免疫反應；在IL-6和TGF-β作用下向Th17分化，產生IL-17等，誘導炎癥反應；在TGF-β作用下向Treg分化，產生IL-10等，實行免疫抑制。T細胞亞群含量和比例及其產生的細胞因子與各種疾病的發生密切相關，過高或過低都有可能導致疾病的發生。

報告細胞因子的熒光報告基因小鼠是轉基因技術的應用，是在T細胞分化后產生的特定細胞因子(例如Th2分化中IL-4)基因下游連接熒光蛋白編碼序列，使細胞因子的產生可以被熒光蛋白報告，并能被熒光探測系統檢測到的一種技術。

傳統T細胞體外培養分化途徑如下：

(1)脾細胞的分離與計數；

(2)細胞的激活培養；

(3)再刺激與抑制蛋白分泌；

(4)表面染色與胞內染色檢測分化；

T細胞體外培養分化的形態學特征如附圖1所示。

傳統T細胞培養分化一般需要4-5天，經激活培養、再刺激、抑制蛋白分泌、胞內染色(此時產生的大量細胞因子)等步驟檢測是否分化為Th細胞或調節性T細胞(Treg)，其中再刺激、抑制蛋白分泌、胞內染色等技術是鑒定初始CD4⁺T細胞是否分化以及分化成為何種Th或Treg細胞的必要手段。要用到包被好Anti-mouse-CD3和Anti-mouse-CD28的培養板，以及Golgi-plug、甲醛、Saponin來對細胞行固定打孔，還要使用熒光標記的胞內細胞因子抗體進行胞內染色。而此過程不僅使篩選藥物變得繁瑣耗時、增加成本費用，也無法實現高通量篩選?；静襟E如下：

1、超凈臺內取哺乳動物脾臟、淋巴結，用注射器針芯碾碎過200目金屬濾網，溶解紅細胞后制成單細胞懸液；

2、96孔包被板Anti-mouse-CD3(10μg/ml)和/或Anti-mouse-CD28(1μg/ml)中，以2×10⁶個細胞/mL密度、200μl每孔培養于RPMI培養基內，并加入抗體與細胞因子刺激初始CD4⁺T細胞分化；

3.48h換液，視細胞密度轉孔，加入新鮮的IL-2(2ng/mL)刺激1天；

4.72h轉到另外包被好的96孔板再刺激。37℃，2-4h；

5.加Golgi-plug，37℃?2h；

6.收細胞于流式管，熒光抗體APC-Anti-mouse-CD4或PE-Anti-mouse-CD4，200倍稀釋(即終濃度1μg/ml)表面染色，遮光冰浴15min；

7.PBS洗去未結合的抗體，離心、棄上清；

8.每管加2％甲醛(in?PBS溶液)2mL，室溫固定30min；

9.PBS洗去甲醛，離心、棄上清；

10.加入2mL配制好的0.5％Saponin溶液，輕輕混勻，遮光室溫打孔30min；

11.離心、棄上清，加Saponin?buffer?100μL，胞內染色遮光冰浴30min；

12.Saponin?buffer洗2遍，PBS洗1遍；

13.每管樣品重懸在0.5mL?PBS中，流式細胞儀檢測(表達某種細胞因子的Tcell)/CD4⁺T?cell百分率。

該種T細胞體外培養分化方法存在的缺點是：步驟繁瑣，耗費時間長，難以應用于藥物高通量篩選。需要的成本較高，Anti-mouse-CD3，Anti-mouse-CD28，Golgi-plug，Saponin一般實驗室難以獲得、且價格昂貴，并非所有實驗室都有這個條件，繁瑣的步驟使得每組數據的平行性很難控制，并且容易受制于胞內染色技術不成熟，常常得不到好的結果。

【發明內容】：本發明目的是克服現有技術存在的上述不足，通過熒光報告基因小鼠T細胞體外培養分化模型及篩選平臺的建立，提供一種省時高效、高通量完成與機體免疫系統各種細胞因子相關的藥物的篩選方法。