[發明專利]一種快速定量線蟲存活率的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201010138624.1
• 申請日: 2010-04-03
• 公開（公告）號: CN102213672A
• 公開（公告）日: 2011-10-12
• 發明（設計）人: 李紅玉;周婷;支德娟
• 申請（專利權）人: 李紅玉
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N1/30
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種快速定量線蟲存活率的方法及試劑盒，該方法及試劑盒可在藥物篩選、農藥篩選、環境評價、水質評價等方面應用，屬于生物技術領域。

背景技術

秀麗隱桿線蟲（C.elegans）是一種生長在土壤中的線蟲，以細菌為食，很容易在實驗室培養。成蟲體長1mm，且通體透明，在顯微鏡下易于觀察。L3～L4期對外界敏感。從一個受精卵發育成可以產卵的成蟲，它只需要3天。在自然狀態下，秀麗隱桿線蟲絕大部分個體為雌雄同體，其一生能產生約300個受精卵，如果在一個培養皿上放幾只線蟲，幾天之后就可得到大量的后代（龐林海等，2007）。上述這些特點使得秀麗隱桿線蟲在很多方面都有應用（秦峰松和楊崇林，2006）。

廈門大學柯翎等人（2004）以秀麗隱桿線蟲作為重金屬污染的指示生物，研究了Cu²⁺，Cd²⁺，Pb²⁺，Zn²⁺等4種重金屬離子對秀麗隱桿線蟲的毒性，發現重金屬離子濃度越高，毒性越強，線蟲死亡率越高。在高濃度組中線蟲的中毒反應較迅速，短期內就出現死亡；而在低濃度組，中毒反應較慢，經較長時間才出現死亡，對照組相對其他各組，存活時間最長。北京師范大學的鄢雯等（2005）人將秀麗隱桿線蟲用于環境水質的監測，同樣發現秀麗隱桿線蟲存活率與水樣毒性之間存在緊密的關系，水樣毒性越大，線蟲死亡率越高，因此可用秀麗隱桿線蟲的存活率評價飲用水源水和水廠工藝水水樣毒性。王曉等人（2007）也將秀麗隱桿線蟲用于對造紙廠廢水中酸堿類毒物的追蹤。實驗顯示，用秀麗隱桿線蟲指示重金屬危害、水樣毒性大小等既降低了實驗成本，又提高了檢測效率。萬樹青（1993）等人用秀麗隱桿線蟲的死亡率來評價棉酚，克線磷，甲基異柳磷，氧樂果，滅多威，硫酸銅等多種農藥的殺蟲效果。國外將秀麗隱桿線蟲用于體內驅蟲藥物藥效篩選的研究已有相關的文章發表（Gnoula等，2007），為驅蟲藥的體外研究提供了可行方法，并且呈現良好的選擇性、準確度及重復性，而且成本低廉。這些研究表明，線蟲死亡率的大小反應了供試藥物的藥效和毒性的大小。王擺（2006）以自由海洋線蟲Chromadorina?sp.為模型動物，選擇水溶性的重金屬鎘離子和不溶于水的環境雌激素雙酚A，以線蟲的死亡率為指標，測試了兩種化學物質對Chromadorina?sp.的急性毒性。由此可見，線蟲可在藥物篩選、農藥篩選、環境評價、水質評價等方面應用。

在以上諸多方面的應用中對線蟲死活的判斷是關鍵技術。在涉及線蟲死亡或存活進行判斷的現有技術中，萬樹青等（1993）人試圖通過染色方法來區分死活線蟲從而測定被測物殺線劑的活性，他們比較了中性紅，甲基藍，番紅花紅，曙紅等4種染料的染色效果，發現這4種染料都能使死線蟲著色，而活線蟲不著色，番紅花紅效果最好。但是這種方法仍然需要在顯微鏡下一一計數，工作量很大。國外學者用MTT法檢測了驅蟲藥物左旋咪唑對自由生活的幼體線蟲存活率的影響（Catherine?等，2007；Smith等2009），但此方法用MTT對線蟲染色的時間為3至24小時，且用DMSO溶出甲臢需要1小時，比較費時。而且，?MTT價格昂貴，sigma公司產品1g參考價格為1413.36元，而同為sigma公司產品的TTC?5g參考價格為243元。美國專利（專利號為20060191023）公開了一種應用熒光染色劑法來鑒別死活線蟲的染色方法。這種方法已用于驅蟲藥物的篩選研究，由于染色后活的線蟲無熒光，而死亡的線蟲有熒光，利用測試熒光強度的大小來確定線蟲的死亡率，這樣為高通量篩選提供了保證，但此法需要熒光酶標儀，對設備要求很高，難以在普通實驗室和基層得以推廣和應用。中國專利（專利號為200710202068.8）公開了一種應用中性紅染料來鑒別死活線蟲的染色方法。該方法可以使死線蟲著色，活線蟲不著色，但染色后需要裂解線蟲釋放染料后再測定染料的吸光值，步驟繁瑣，比較費時。

通過對上述涉及線蟲死亡或存活進行判斷的現有技術分析可以看出，現有技術費時、費力、而且成本較高或需要昂貴的儀器設備，市場急需一種簡單易行、成本低廉、不需昂貴的儀器設備就能進行快速定量線蟲存活率的新方法，可以廣泛應用于新藥篩選、農藥篩選、環境評價及水質評價等領域。

參考文獻：

1.龐林海等，秀麗隱桿線蟲的培養與保存方法，浙江農業學報，2007，19（1）：34～36.