[發明專利]一種海藻糖的生產方法

有效

• 申請號: 201010137964.2
• 申請日: 2010-04-02
• 公開（公告）號: CN101831474A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 王瑞明;馬春玲;王騰飛;李丕武;徐汝意
• 申請（專利權）人: 山東輕工業學院
• 主分類號: C12P19/12
• 分類號: C12P19/12;C12R1/40
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 趙會祥

技術領域

本發明涉及一種海藻糖的生產方法，特別是一種利用惡臭假單胞菌生產海藻糖的方法，屬于發酵工程及微生物技術領域。

背景技術

海藻糖(Trehalose)，又名蘑菇糖、覃糖，它的分子式為C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O，化學名α-D-吡喃葡萄糖基α-D-吡喃葡萄糖苷(α-D-glycopyranosyl-α-D-glycopyranoside)，是由兩個葡萄糖分子通過半縮醛羥基縮合而成的非還原性雙糖。廣泛存在于細菌、酵母、真菌、藻類和昆蟲中。海藻糖具有獨特的生物學功能，可以保護蛋白質，生物膜及敏感細胞的細胞壁免受干旱、冷凍和滲透壓的變化而造成的傷害，可作為不穩定藥品、食品和化妝品的穩定劑、多種食品和藥品甜味劑、種子的包衣、冷凍干燥菌株的保護劑等；海藻糖還可保護DNA防止放射線引起的損傷。

海藻糖的生產方法包括微生物抽提法、化學合成法、微生物發酵法、基因重組法、酶轉化法等。酶轉化法制取海藻糖的途徑有多種，按其作用的底物，主要分為以葡萄糖、麥芽糖、淀粉為底物的三種方法。

1、以葡萄糖為底物

人們在研究酵母的生物合成途徑時，發現酵母利用體內的6-P-海藻糖合成酶和6-P-海藻糖磷酸酯酶，經兩步作用將兩個葡萄糖分子轉化為海藻糖。據此，Hidcki?Kizawa等人在小球菌變異株菌體內提取出合成酶，轉化葡萄糖為海藻糖。但這一過程需要消耗高能物質UDP或GDP，且酶活很不穩定，因此用該方法很難實現大規模的工業化生產。

2、以麥芽糖為底物

以麥芽糖為底物的酶轉化法目前發現有兩種。

(1)利用某些磷酸化酶由麥芽糖二步轉化為海藻糖

Sawao?Murao等詳細研究了由麥芽糖生物合成海藻糖的途徑：

第一步反應：麥芽糖在海藻糖磷酸化酶的作用下生成葡萄糖和β-葡萄糖-1-磷酸。第二步反應是葡萄糖和β-葡萄糖-1-磷酸在海藻糖磷酸化酶作用下生成海藻糖和磷酸。日本專利曾介紹用麥芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶處理麥芽糖就可以生產海藻糖。酶反應完成后，從反應液中除去沉淀物，含有海藻糖的液體進一步用陰離子交換樹脂純化，然后，再用一種硼酸型陰離子交換樹脂吸附海藻糖，采用硼酸鉀分級洗脫和收集。含有海藻糖部分經陽離子交換樹脂處理和濃縮，然后加入少量乙醇蒸餾除去硼酸，最后的濃縮液用乙醇進行重結晶，可得到二水海藻糖晶體。研究表明，此法反應生產海藻糖轉化率較低且酶制備及產物提取困難，不適宜于工業化生產。

(2)利用海藻糖合酶將麥芽糖-步轉化為海藻糖

許多細菌中都有海藻糖合酶，如脂肪桿菌(Pimelobacter?sp.)、惡臭假單孢菌(Pseudomonas?putida)、水生嗜熱菌(Thermus?aquaticus)等。這種酶是分子內轉糖基酶，能將麥芽糖的α-1，4糖苷鍵轉化成α-1，1糖苷鍵，但不作用于葡萄糖，麥芽三、四、五糖，麥芽寡糖、曲二糖、黑曲霉二糖、異麥芽糖、海藻寡糖、蔗糖、松二糖、異麥芽寡糖和乳糖。這種酶在催化麥芽糖轉化為海藻糖的過程中不消耗高能物質，不需要磷酸，且轉化率高達70-80％，海藻糖產率和麥芽糖的濃度(2.5％-40％)無關。這為海藻糖的大規模生產提共了有利條件。

該酶催化麥芽糖生成海藻糖的反應是：

(3)以淀粉或淀粉水解物為底物

低聚麥芽糖苷基海藻糖生成酶(MTSase)和低聚麥芽糖苷基海藻糖水解酶(MTHase)是首先在節桿菌Q36中發現的，這兩種酶能作用于麥芽寡糖或淀粉生成海藻糖。其中以直鏈淀粉為底物生產海藻糖的機理如下：

該反應分兩步完成，第一步，MTSase由麥芽低聚糖(淀粉液化液)的還原性末端開始，通過分子內轉苷作用，將α-1，4鍵轉變成α-1，1鍵，使原麥芽低聚糖轉變為帶有一個海藻糖結構的麥芽低聚糖，是一種分子內轉糖基酶，稱為麥芽寡糖基海藻糖合酶；第二步，MTHase專一地作用于α-1，1鍵相鄰的α-1，4鍵，從而使原麥芽低聚糖變為少兩個葡萄糖苷的低聚糖和游離的海藻糖，稱為麥芽寡糖海藻糖基水解酶。如果n-2≥3，則上述反應繼續進行，所以如果反應完全，其最終產物主要為海藻糖及一部分葡萄糖和麥芽糖。

目前商品化的海藻糖主要從酵母細胞中提取，收率低且成本高，限制了海藻糖的廣泛應用。

發明內容