[發明專利]檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的試劑盒及方法

無效

• 申請號: 201010137439.0
• 申請日: 2010-03-31
• 公開（公告）號: CN101824474A
• 公開（公告）日: 2010-09-08
• 發明（設計）人: 危芙蓉;張儀;劉和香;周曉農;呂山;胡玲
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 王函

1.一種檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有：(A)CTAB裂解液，該CTAB裂解液含有2％CTAB，20mmol/L?EDTA，0.1mol/L?Tris-Cl和1.4mol/L?NaCl；(B)巰基乙醇；(C)20mg/mL的蛋白酶K；(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液，苯酚∶氯仿∶異戊醇為25∶24∶1；(E)Tris-EDTA緩沖液，該緩沖液含10m?mol/LTris-Cl和1mmol/L?EDTA，pH為8.0；(F)2×Master?PCR?Mix；(G)10μmol/L的引物，所述引物含有引物1和引物2，該引物1的序列為：上游：5’-CGC?CTG?TTT?AAC?AAA?AAC?AT-3’(SEQ?ID?NO：1所示序列)，下游：5’-CCG?GTC?TGA?ACT?CAG?ATC?ATG?T-3’(SEQ?ID?NO：2所示序列)；該引物2的序列為：上游：5’-GCA?AAT?GCT?TTC?GCT?TTA?GG-3’(SEQ?IDNO：3所示序列)，下游：5’-AAT?GGC?AGG?GAC?GTA?ATC?AG-3’(SEQ?ID?NO：4所示序列)。

2.如權利要求1所述的檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的試劑盒，其特征在于，該試劑盒可抽提DNA?100次，含有(A)CTAB裂解液50-70ml，(B)巰基乙醇800-1000μl，(C)20mg/mL的蛋白酶K?500-700μl，(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液120-200ml，(E)Tris-EDTA緩沖液6-15ml，(F)2×Master?PCR?Mix?F?750μl，(G)10μmol/L的引物60μl。

3.一種檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的方法，包含如下步驟：

1)小管福壽螺肺囊組織粉碎后，取≤100mg，加入如權利要求1所述的(A)CTAB裂解液500-700μl，(B)巰基乙醇8-10μl以及(C)20mg/mL的蛋白酶K?5-7μl，60℃水浴5-10小時至完全消化；

2)加入如權利要求1所述的(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液500-700μl，充分混勻，常溫下10,000-16,000rpm離心10min；

3)取上清，加入等體積的如權利要求1所述的(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液，充分混勻，常溫下10,000-16,000rpm離心10min；

4)重復第3)步；

5)取上清，加入2-3倍體積95％或無水乙醇，常溫下11,000-13,000rpm離心10min；

6)棄上清，取沉淀，加入500μl?70％或75％乙醇洗滌，常溫下10,000-13,000rpm離心5min；

7)棄上清，沉淀自然或烘箱中烘干；

8)加入如權利要求1所述的(E)Tris-EDTA緩沖液60-150μl溶解，-20℃保持備用；

9)將步驟8)的產物進行PCR反應：將雙蒸滅菌水5.9μl，如權利要求1所述的(F)2×Master?PCR?Mix?7.5μl，如權利要求1所述的(G)10μmol/L的引物0.60μl，步驟8)獲取的DNA樣本1μl，充分混勻后500-5000rpm簡短離心5-10s，進行PCR反應；

10)PCR產物取6μl進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，判斷小管福壽螺感染情況。

4.如權利要求3所述的檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的方法，其特征在于，步驟9)中PCR反應的條件為：95℃預變性5min后進行94℃變性1min、56℃退火45s、72℃延伸1min的35個循環的擴增，72℃延伸7min后保存。