[發明專利]檢測殘留的氯霉素的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201010128316.0
• 申請日: 2010-03-17
• 公開（公告）號: CN101788560A
• 公開（公告）日: 2010-07-28
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 北京阿匹斯生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N21/31
• 代理公司: 北京銀龍知識產權代理有限公司 11243
• 代理人: 鐘晶

1.一種檢測殘留的氯霉素的酶聯免疫試劑盒，包括微孔板(1)、氯霉素 標準樣品(2)、濃縮洗滌液(3)、濃縮酶標氯霉素(4)、酶標稀釋液(5)、底 物液(6)和終止液(7)，

其中所述微孔板(1)是包被有兔抗氯霉素IgG的微孔板，即用0.05mol/L 的pH值為9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃緩沖液將兔抗氯霉素IgG稀釋至0.1μg/mL， 按每孔100μL的量添加到所述微孔板中，在4℃下放置過夜，棄去包被液， 用稀釋后的洗滌液洗板3次，真空抽干，將該微孔板密封后置-20℃下保存；

所述濃縮酶標氯霉素(4)是10～100倍濃縮酶標氯霉素，其用碳二亞胺法將 琥珀酸鈉氯霉素連接到卵清白蛋白上制備琥珀酸鈉氯霉素-卵清白蛋白，然后 用高碘酸鈉法將辣根過氧化物酶標記到琥珀酸鈉氯霉素-卵清白蛋白上制備成 琥珀酸鈉氯霉素酶標物，用酶聯免疫吸附試驗測定琥珀酸鈉氯霉素酶標物原液 的工作濃度，將琥珀酸鈉氯霉素酶標物原液用含體積比10％小牛血清的PBS 稀釋至在0.1μg/mL～1μg/mL之間的工作濃度的10～100倍，該琥珀酸鈉氯 霉素酶標物溶液即為10～100倍濃縮酶標氯霉素。

2.根據權利要求1所述的檢測殘留的氯霉素的酶聯免疫試劑盒，其中所 述氯霉素標準品(2)的濃度分別為0μg/kg、0.03μg/kg、0.09μg/kg、0.27μg/kg、 0.81μg/kg和2.43μg/kg。

3.根據權利要求1所述的檢測殘留的氯霉素的酶聯免疫試劑盒，其中所 述濃縮洗滌液(3)是5～10倍濃縮洗滌液；

所述酶標稀釋液(5)由小牛血清和所述洗滌液按體積比1∶9組成；

所述底物液(6)包含5.37g/L的一水檸檬酸、19.38g/L的Na₂HPO₄.12H₂O、 50mg/L的3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺、25mg/L的過氧化氫脲和體積比5％的N，N- 二甲基甲酰胺；

所述終止液(7)是0.5mol/L的鹽酸。

4.根據權利要求3所述的檢測殘留的氯霉素的酶聯免疫試劑盒，其中， 所述濃縮洗滌液(3)是10倍濃縮洗滌液，其包含80g/L的NaCl、2g/L的KCl、 29g/L的Na₂HPO₄·12H₂O、2g/L的KH₂PO₄和5ml/L的吐溫-20；所述濃縮酶 標氯霉素(4)是20倍濃縮酶標氯霉素。

5.一種用權利要求1所述的試劑盒檢測殘留的氯霉素的酶聯免疫方法， 所述方法是基于抗原抗體反應進行競爭性抑制測定，其包括以下步驟：

(I)待測樣品的預處理，即將待測試的樣品處理為體液樣品，或者用有 機溶劑提取待測樣品、蒸干并且將其復溶于PBS制得溶液樣品；

(II)取包被有兔抗氯霉素IgG的微孔板，加入100μL氯霉素標準品和 處理后的樣品到對應微孔中；

(III)加入50μL用酶標稀釋液將所述的濃縮酶標氯霉素稀釋至工作濃度 的酶標氯霉素，振蕩混勻后于37℃下避光靜置孵育30分鐘，用洗滌液洗滌3 次，在吸水紙上拍干；

(IV)加入100μL底物液，于室溫下避光靜置10分鐘，加入100μL反 應終止液到微孔中，混合均勻后盡快在450nm或雙波長450nm/630nm處測 量吸光度值；以及

(V)以標準品測試的結果繪制標準曲線，對照標準曲線計算測試樣品中 的氯霉素的含量。

6.根據權利要求5所述的檢測殘留的氯霉素的酶聯免疫方法，其中，所 述酶標氯霉素的制備過程分兩步：先用碳二亞胺法將琥珀酸鈉氯霉素連接到卵 清白蛋白上制備琥珀酸鈉氯霉素-卵清白蛋白，然后用高碘酸鈉法將辣根過氧 化物酶標記到琥珀酸鈉氯霉素-卵清白蛋白上制備成琥珀酸鈉氯霉素酶標物。

7.根據權利要求5所述的檢測殘留的氯霉素的酶聯免疫方法，其中，所 述處理后的樣品是經過以下處理的樣品：

1)取尿液樣品置離心機中，用12000g的離心力離心2分鐘，取上清，用 0.15mol/L的pH值為7.4的PBS稀釋1倍；

2)取血清樣品置離心機中，用12000g的離心力離心2分鐘，取上清，用 0.15mol/L?pH值7.4的PBS稀釋1倍；

3)取3.0克已均質后的豬肉樣品于離心管中，加入6mL乙酸乙酯，漩渦 混合1分鐘，然后3000rpm離心10分鐘，取2mL上層液-乙酸乙酯，在50℃ 下氮氣吹干，再加入正己烷1mL，待殘余物完全溶解后，再加入1mL的含 0.05％的吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，漩渦混合30秒鐘；3000rpm離心10分鐘， 吸去包含中間乳化層部分的上層液-正己烷，吸取下層液-水層作為處理后的樣 品。