[發明專利]一種用于促進胰島素分泌的基因、其制備方法及其應用

無效

• 申請號: 201010126655.5
• 申請日: 2010-03-17
• 公開（公告）號: CN101935656A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 鄭大;趙璟;余抗抗;陳付學
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;A61K48/00;A61P5/48;A61P3/10
• 代理公司: 上海上大專利事務所(普通合伙) 31205
• 代理人: 陸聰明

技術領域：

本發明涉及一種用于促進胰島素分泌的基因、其制備方法及其應用。

背景技術

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)現象是一種雙鏈RNA(doublestrandedRNA?dsRNA)引發的轉錄后基因靜默機制。將與靶基因的轉錄產物mRNA存在同源互補序列的雙鏈RNA(double?strand?RNA，dsRNA)導入細胞后，能特異性地降解該mRNA，從而產生相應的功能表型缺失，這一過程屬于轉錄后基因沉默機制(posttranscriptional?gene?siliencing，PTGS)范疇。RNAi廣泛存在于生物界，從低等原核生物，到植物，真菌，無脊椎動物，甚至近來在哺乳動物中也發現了此種現象，機制也更為復雜。

發明內容：

本發明的目的之一在于提供一種用于促進胰島素分泌的基因。

本發明的目的之二在于提供該基因的制備方法。

本發明的目的之三在于提供該基因的應用。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種用于促進胰島素分泌的基因，其特征在于該基因具有下列核苷酸序列之一：

(1).具有SEQ?NO?1所示的DNA序列；

(2).與序列表中序列1限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。。

一種制備上述的用于促進胰島素分泌的基因的方法，其特征在于該方法的具體步驟為：根據SilenCircle?TM?RNAi?Transcription?Kit中載體設計的具體要求，設計對應于Kir6.2基因733-753位，即GCA?TCT?TCA?TGA?AAA?CGG?CAC的shRNA的寡核苷酸序列引物，各為53bp，然后進行合成，得到用于促進胰島素分泌的基因；所述的shRNA的寡核苷酸序列引物為：

Sense：5’-ACA?CCG?CAT?CTT?CAT?GAA?AAC?GGC?TTG?CTT?GAA?GCC?GTT?TTC?ATG?AAG?ATG?CT-3’

Anti-sense：：5’-AAA?AAG?CAT?CTT?CAT?GAA?AAC?GGC?TTC?AAG?CAA?GCC?GTT?TTC?ATG?AAGATG?CG-3’。

一種上述的用于促進胰島素分泌的基因在制備促進胰島素的分泌藥物中的應用。

本發明設計對與胰島素分泌有關聯的基因的RNAi，并應用胰島β細胞模型研究其對胰島素分泌的促進作用。為RNAi在糖尿病的治療應用提供了一種新方法。

附圖說明

圖1為shRNA的寡核苷酸序列引物和P^SilenCircle質粒的連接圖。

具體實施方式：

一、正常胰島β細胞的培養：胰島β細胞HIT-15細胞系培養于37℃，5％CO₂恒溫培養箱。對數生長期的細胞用胰酶消化脫壁，再加入適量培養液以易于混勻細胞；用移液器將其移入15ml離心管中，1500rpm離心3min；去上清；用5ml無菌1×PBS將細胞懸起，并吹打混勻；加約1ml細胞懸液于裝有5ml新鮮培養基的新培養瓶中，放入37℃，5％CO₂培養箱中培養，約3天左右傳代1次(主要查看細胞有無鋪滿培養瓶)。

二、大鼠胰島β細胞的分離：正常大鼠和“糖尿病”大鼠一只，體重200～300g.頸椎脫臼處死后消毒腹部，迅速打開左側腹腔，沿脾動脈剪取胰腺體尾部分，立即浸入4℃的KRBB溶液中.清洗二次，剪去白色脂肪組織，然后將胰腺剪成小塊，轉移至盛有5mL消化酶液的三角瓶中，于恒溫搖床中37℃保溫，搖床轉速100r/min，每10min玻璃管反復吹打一次，放置30min將該懸液離心500-1000rpm，離心5min，最后剩下的為夾有少量腺泡團的胰島.在黑背景的體視顯微鏡下，胰島呈圓或橢圓形，灰色或淡棕色，易與腺泡團分辨開.將胰島用玻管挑出，每只大鼠可以得到直徑在100-300μm的胰島80-100個。

三、Kir6.2-RNAi質粒的設計和轉染：根據SilenCircle?TM?RNAi?Transcription?Kit中載體設計的具體要求，設計對應于Kir6.2基因733-753位(GCA?TCT?TCA?TGA?AAA?CGG?CAC)的shRNA的寡核苷酸序列引物，各為53bp，并進行合成。

Kir6.2-RNAi對應的序列為：