[發明專利]一種聯合診斷胃病或評價胃癌風險的酶聯免疫吸附試劑盒

無效

• 申請號: 201010122781.3
• 申請日: 2010-03-11
• 公開（公告）號: CN102087279A
• 公開（公告）日: 2011-06-08
• 發明（設計）人: 金鑫;王瑞環
• 申請（專利權）人: 北京美康生物技術研究中心
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N30/06;G01N33/577;C12N5/20;C07K16/40
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

1.一種診斷胃病或評價胃癌風險的酶聯免疫吸附試劑盒，包括：包被有抗胃蛋白酶原I抗體或抗胃蛋白酶原II抗體的微孔板、酶標抗體、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液。

2.按照權利要求1所述的酶聯免疫吸附試劑盒，其特征在于：所述的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II是從人胃粘膜組織中提取得到的天然蛋白。

3.按照權利要求2所述的酶聯免疫吸附試劑盒，其特征在于，所述的從人胃粘膜組織中提取得到胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II的方法，包括：

(1)收集外科手術切除的正常胃組織，用磷酸鹽緩沖液漂洗，分離胃粘膜，吸干，稱重，加入磷酸鹽緩沖液，搗碎勻漿，離心，收集上清，沉淀磷酸鹽緩沖液重懸，再次離心，合并上清液，得到胃蛋白酶原粗提液；

(2)將胃蛋白酶原粗提液加入已經平衡的DEAE-52層析柱，用PBS緩沖液洗脫層析柱至在280nm處，吸光值為0，繼續用PBS緩沖液洗脫層析柱，合并洗脫峰，得到含有活性的胃蛋白酶原；

(3)取活性蛋白酶原峰，上樣于凝膠層析柱中，用50mmol含0.05mol/LNa₂SO₄的PBS洗脫，流速3.0ml/min，壓力為8Kpa，洗脫曲線為顯示4個蛋白洗脫峰，第三個蛋白峰即為胃蛋白酶原I，第四個蛋白峰為胃蛋白酶抗原I及胃蛋白酶原II的混合物；

(4)采用Q-2陰離子交換層析柱分離胃蛋白酶原I和胃蛋白酶抗原II的混合物，凝膠層析后的第四個洗脫峰先用0.05mol/L?Tris-HCL，pH7.0透折后上樣陰離子層析柱，用濃度為0-0.5mol/L?NaCL梯度洗脫，流速為1mL/min；出現三個蛋白峰，其中第1個，2個峰為胃蛋白原原I，第三峰為胃蛋白原原II。

4.按照權利要求1所述的酶聯免疫吸附試劑盒，其特征在于：所述的抗胃蛋白酶原I抗體或抗胃蛋白酶原II抗體的制備方法包括：將權利要求2或3所述的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II免疫小鼠制備融合細胞，得到分泌抗胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II的雜交瘤細胞株，培養雜交瘤細胞株，分別得到抗胃蛋白酶原I單克隆抗體或抗胃蛋白酶原II單克隆抗體。

5.按照權利要求4所述的酶聯免疫吸附試劑盒，其特征在于：所述的抗胃蛋白酶原I抗體或抗胃蛋白酶原II抗體的制備方法包括：(1)融合細胞的制備：用50-100μg權利要求2或3所述的人胃蛋白酶原I或人胃蛋白酶原II與福氏完全佐劑等體積混合皮下注射免疫8周齡的雌性BALB/C小鼠，間隔2-3周后，用同樣劑量的抗原加強免疫2-3次，末次免疫后3-4天取尾靜脈血檢測，當效價達到4000以上時，準備融合；將經免疫的小鼠處死后，局部消毒剖腹，無菌條件下取脾，制備成脾細胞懸液；融合前2-3天，將每瓶Sp2/0骨髓瘤細胞傳至4瓶細胞，取處于對數生長期的細胞用于融合；將脾細胞和SP2/0細胞分別計數后，按7∶1的比例加入離心管中混合均勻，離心，倒盡上清液，使兩種細胞混勻成糊狀，加入預溫的50％PEG4000，邊滴加邊攪拌完成細胞融合；

(2)融合后的細胞用含20％小牛血清的HAT培養液制備成細胞懸液，分劃于192孔細胞培養板中進行選擇培養；在選擇培養液中培養4天后，其它細胞逐漸消失，只有融合的雜交瘤成簇生長，形成小的細胞集落，8天后，停止使用HAT培養液，改用HT培養液，一周后換用含10％牛血清的DMEM培養液培養；待雜交瘤細胞長滿培養孔底部的1/3時，這時吸取培養上清進行篩選。用間接酶聯吸附法(ELISA)進行特異性抗體檢測，有分泌抗ALB抗原抗體的雜交瘤細胞；

(3)以人胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II為包被抗原，用間接ELISA方法對雜交瘤細胞進行篩選，以免疫小鼠的血清為陽性對照，以Sp2/0細胞培養的上清液為空白對照，以細胞培養板中未長出克隆的培養上清為陰性對照；選取對胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II抗原陽性反應的雜交瘤細胞集落，以有限稀釋法進行克隆化培養，選擇抗體效價高，呈單個克隆生長，形態良好的細胞孔，繼續按有限稀釋法進行2次克隆和擴大培養，得到分泌特異抗體的雜交瘤細胞株；

(4)在同系的6周齡BALB/c腹腔注射液體石蠟，約第8天將克隆后分泌特異單克隆抗體的雜交瘤細胞注入腹腔，待小鼠腹部開始增大后，收集腹水；一只小鼠收集腹水2-3次后，殺死小鼠一次性取腹水，腹水取出后，無菌過濾后，小包裝分裝凍存，亦可取部分進一步進行純化；

(5)離心除去腹水中的細胞和細胞碎片，加入等體積的飽和硫酸銨到上清液中，將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6小時，使蛋白質充分沉淀，將沉淀物溶于少量的PBS中，用10mmol/LPBS透析；然后通過DEAE-Sephadex?A52層析柱，收集并合并洗脫液中含蛋白的部分，即得到純化的抗胃蛋白酶原I或抗胃蛋白酶原II單克隆抗體。