[發明專利]一種利用轉基因不定根繁殖根結線蟲的方法

無效

• 申請號: 201010113861.2
• 申請日: 2010-02-25
• 公開（公告）號: CN101899470A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發明（設計）人: 向太和;孟莎莎;王琳
• 申請（專利權）人: 杭州師范大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/06;A01K67/033
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及一種利用轉基因不定根繁殖根結線蟲的方法。

(二)背景技術

根結線蟲主要包括南方根結線蟲(Meloidogyne?incognite)、爪哇根結線蟲(M.javanica)、花生根結線蟲(M.arenaria)和北方根結線蟲(M.hapla)四種，根結線蟲是葫蘆科、茄科、豆科作物的一種毀滅性蟲害。根結線蟲的危害主要表現在形成根結，造成根系發育受阻和腐爛，植株地上部衰弱和枯死；同時，根結線蟲的危害又加重了枯萎病、根腐病等土傳性真菌病害和部分細菌病害的發生。根據聯合國糧農組織的估計，每年線蟲給蔬菜作物造成的損失超過產量的20％。為了研究根結線蟲的防控以及接種鑒定根結線蟲，需要繁殖分離根結線蟲。目前對根結線蟲的繁殖通常利用煙草、番茄等植物的實生苗作為宿主，在適宜的季節或者利用溫室、人工氣候室進行，這是一項繁雜、費時、費力的工作，受到季節和試驗條件的限制(劉維志，《植物病原線蟲學》，中國農業出版社，2000年，第414～428頁；馮志新，《植物線蟲學》，中國農業出版，2001年，第68～203頁。)

另一方面，發根農桿菌侵染植物形成轉基因不定根，不定根具有快速生長繁殖的特性；不定根在形態上保持了植物原根系統的特征，在生理上具有原根系統完整的代謝通路；不定根起源于單細胞而不存在嵌合體，在遺傳上具有高度的穩定性和一致性；不定根在適宜條件下可以再生出完整植株；不定根可以作為生物活性物質的發生器(Guillon?S，Tremouillaux-Guiller?J，Pati?P?K，Rideau?M，Gantet?P.Hairy?root?research：recent?scenario?and?exciting?prospects.Curr?Opin?Plant?Biol，2006，9(3)：341-346.Georgiev?M?I，Pavlov?A?I，Bley?T.Hairy?root?type?plant?in?vitrosystems?as?sources?of?bioactive?substances.Appl?Microbiol?Biotechnol，2007，74(6)：1175-1185.)。

目前還未有利用轉基因不定根繁殖根結線蟲的報道。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種利用轉基因不定根繁殖根結線蟲的方法，實現對根結線蟲了快速、簡便、大量、均一的繁殖。

一種利用轉基因不定根繁殖根結線蟲的方法，所述方法包括：

(1)用發根農桿菌K599侵染帶有傷口的黃瓜子葉，侵染后的黃瓜子葉于含乙酰丁香酮25mg/L的MS培養基中共培養2～3天后，用含頭孢霉素500mg/L的MS培養基清洗，再轉入含卡那霉素50mg/L+頭孢霉素500mg/L的MS培養基中進行誘導培養，誘導出的不定根經除菌和繁殖，獲得轉基因不定根于不含任何植物激素和抗生素的MS培養基中繁殖保存；

(2)挑取根結線蟲的卵囊，經消毒后接種至培養于MS培養基中的轉基因不定根上，于20～25℃下進行培養30～50天，在形成的根結中獲得根結線蟲。

具體的，所述步驟(2)方法如下：番茄苗接種根結線蟲，常規條件培養40～50天后，挑取根上的根結線蟲卵囊，用0.1％升汞消毒5min，無菌水清洗后，接種至轉基因不定根進行培養。培養條件為：溫度20～25℃，濕度75％以上，12h/8h光照黑暗交替，光強1200～2400Lux。

所述發根農桿菌K599可為野生型發根農桿菌K599，為便于檢測，也可為帶有標記基因的重組發根農桿菌K599，所述重組發根農桿菌K599可含有本領域常規用作植物轉基因表達載體的質粒，具體可為下列之一：(1)pBIN-35S-GFP、(2)pBI121、(3)pCAMBIAL300、(4)pCHS、(5)pKH200等。

作為優選的技術方案，所述發根農桿菌K599可選用含有質粒pBIN-35S-GFP的重組發根農桿菌K599。

所述質粒pBIN-35S-GFP為含CaMV?35S啟動子驅動和gfp基因(GenBank登記號：U17997)的植物轉基因表達載體，可參照《含gfp植物轉基因表達載體的構建及在矮牽牛轉基因不定根中的高效表達》(徐紀明，向太和，2008年)中的方法進行構建，具體構建過程見圖1。