[發明專利]用于抑制LeY糖抗原合成的巖藻糖基轉移酶Ⅳ的RNA干涉序列及重組干涉質粒

無效

• 申請號: 201010108583.1
• 申請日: 2007-01-15
• 公開（公告）號: CN102094019A
• 公開（公告）日: 2011-06-15
• 發明（設計）人: 張振波;閆杰;劉基巍;富力;王曉琦;燕秋
• 申請（專利權）人: 燕秋
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 大連萬友專利事務所 21219
• 代理人: 王發

本申請是<用于抑制LeY糖抗原合成的巖藻糖基轉移酶I和IV的RNA干涉序列及重組干涉質粒>申請號200710010099.3，申請日2007年01月15日的分案申請。?

技術領域本發明涉及一種特異的DNA序列及根據該序列構建的重組干涉質粒。?

背景技術惡性腫瘤是一種較為難治的疾病，尚無理想的治療方法。目前，對腫瘤的治療策略主要是采取外科手術、放射治療和化學治療等綜合手段，但每一種方法仍具有局限性并可產生一定程度的毒副作用。?

發明內容本發明的目的在于提供一種依據腫瘤特異糖抗原合成及腫瘤生長、浸潤、轉移等分子機制所構建的，用于抑制LeY腫瘤寡糖抗原合成的巖藻糖基轉移酶I和IV的RNA干涉序列及重組干涉質粒。本發明主要是：應用RNAi(RNAi，RNA?interference)技術以腫瘤的特異糖抗原為靶位點，抑制細胞表面Lewis?Y(LeY)腫瘤寡糖抗原的合成。LeY分子結構為Fucα1→2Galβ→4(Fucα1→3)GlcNAc)，即通過設計并合成LeY腫瘤寡糖抗原的關鍵酶巖藻糖基轉移酶I(Fucosyltransferase?I，簡稱FUT1)和巖藻糖基轉移酶IV(Fucosyltransferase?IV，簡稱FUT4)基因的干涉序列，并采用分子克隆重組技術構建重組FUT1干涉質粒(pSilencer-4.1-FUT1SiRNA)和重組FUT4干涉質粒(pSilencer-4.1-FUT4SiRNA)，用于抗腫瘤藥物應用。?

本發明的技術方案如下：?

1.設計并合成FUT1和FUT4基因的干涉序列?

應用DNASTAR軟件分析了GenBank中全部的人的FUT1/FUT4基因的同源序列，FUT1/FUT4基因的編碼序列的全長分別為1098bp和1218bp，從SiRNA設計軟件獲得的用于抗腫瘤生長的重組FUT1/FUT4的干涉質粒的DNA模板序列中各選取7條作為形成干涉序列的模板DNA序列，長度均為19bp。其中，所設計的FUT1基因的干涉序列為：FUT1-1：TGGCCGGTTTGGTAATCAG；FUT1-2：AGACTTTGCCCTGCTCACA；FUT1-3：GAGGAGTACGCGGACTTGA；FUT1-4：CAGATCCGCAGAGAGTTCA；FUT1-5：CGGCATGGAGTGGTGTAAA；FUT1-6：TGGCCTTCCTGCTAGTCTG；FUT1-7：TTCGCCTTTCCTCCCCTGC。這些序列在FUT1基因中的位置如圖1所示。所設計的FUT4基因的干涉序列為：FUT4-1：GCCTGGCAAGTAACCTCTT；FUT4-2：GTAACCTCTTCAACTGGAC；FUT4-3：CGGACGTCTTTGTGCCTTA；FUT4-4：CATGTGACCGTGGACGTGT；FUT4-5：GTTCTACCTGGCTTTCGAG；FUT4-6：CTCGTACCTGCTTTTCCTC；FUT4-7：GCGGAGGCAGCGCTGCCTG。這些序列在FUT4基因中的位置如圖2所示。?

2.構建重組FUT1干涉質粒和構建重組FUT4干涉質粒?

①根據SiRNA設計軟件獲得用于抗腫瘤生長的重組FUT1/FUT4的干涉質粒的DNA模板序列，它是以上述FUT1/FUT4基因的調控區和編碼區的序列進行干涉質粒的構建。?

②根據pSilencer-4.1-CMV-neo(Ambion，Inc)載體結構信息設計插入載體的FUT1/FUT4干涉質粒的DNA模板序列，即以干涉載體的多克隆酶切位點(HindIII、BamH?I)為基礎，設計與干涉載體有相同粘性末端的FUT1/FUT4SiRNA模板的DNA序列，分別構建7個FUT1干涉質粒：pSilencer-4.1-FUT1-1/FUT1-2/FUT1-3/FUT1-4/FUT1-5/FUT1-6/FUT1-7；7個FUT4的干涉質粒：?pSilencer-4.1-FUT4-1/FUT4-2/FUT4-3/FUT4-4/FUT4-5/FUT4-6/FUT4-7。每條鏈的5`末端含有HindIII或BamH?I的酶切位點(下劃線標出)。具體序列如下：?

FUT1-1(5’-3’)?

GATCCTGGCCGGTTTGGTAATCAGTTCAAGAGACTGATTACCAAACCGGCCAGGA?