[發明專利]一種比率型熒光探針及其應用

有效

• 申請號: 201010108366.2
• 申請日: 2010-02-10
• 公開（公告）號: CN102146284A
• 公開（公告）日: 2011-08-10
• 發明（設計）人: 關亞風;袁景利;宋翠紅
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明涉及過氧亞硝酸陰離子的測定技術，具體地說是一種基于稀土配合物的過氧亞硝酸陰離子比率型熒光探針及應用，是一種可用于生物體系中過氧亞硝酸陰離子選擇性熒光測定的比率型稀土熒光探針。

背景技術

生物體系中的過氧亞硝酸陰離子(ONOO^-)是由一氧化氮(NO)和超氧陰離子自由基(O₂^-)迅速結合生成的一種重要的氮氧活性化合物。通常認為，ONOO^-是較NO和O₂^-氧化作用更強、作用更為廣泛的一種強效細胞毒性物質(文獻1：J.S.Beckman，T.W.Beckman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1990，87，1620；文獻2：G.Ferrer-Sueta，R.Radi，ACS?Chem.Biol.2009，4，161)。作為一種強氧化劑，由于ONOO^-能產生細胞及組織的氧化損傷，因此與多種病癥：如休克、急慢性炎癥、敗血癥、外傷性局部缺血和動脈硬化等相關聯(文獻3：C.Szabo，H.Ischiropoulos，R.Radi，Nat.Rev.Drug?Discov.2007，6，662)。同時，它還能氧化細胞膜、巰基官能團和酶、蛋白、脂質及DNA等生物大分子，是導致細胞損傷、能量耗竭和細胞死亡的重要因素。由于ONOO^-具有很高的運動性，可以很容易地穿透脂類雙層，這使它不僅僅能破壞細胞，而且能滲透到附近的細胞，這些性質都加劇了ONOO^-對生物體的破壞作用。

為了從分子水平上認識ONOO^-對細胞、組織及整個生物體的氧化作用機制，上世紀90年代開始，生物化學家對于生物體系中ONOO^-的生成、代謝以及其病理損傷機理進行了大量研究。然而，由于在生物體內ONOO^-具有極強的反應活性和極短的存在時間(半衰期只有0.8s)，而且可與許多不同的化合物發生化學反應，生成各種各樣的反應產物，這就給生物體系中ONOO^-的測定帶來許多困難。目前，生物體系中ONOO^-的測定主要有以下兩種方法：(1)基于ONOO^-與探針分子的反應所產生的信號變化來測定的方法，包括紫外-可見光度法、熒光法、電化學法和化學發光法(文獻4：S.B.Digerness，K.D.Harris，J.W.Kirklin，Free?Radic.Biol.Med.1999，27，1386；文獻5：J.Xue，X.Ying，J.Chin，Anal.Chem.2000，72，5313；文獻6：S.Dikalov，M.Skatchkov，E.Basseneg，Biochem.Biophys.Res.Commun.1997，230，54)；(2)通過測定ONOO^-與生物分子的反應產物來推測ONOO^-的方法，如測定蛋白質分子中酪氨酸硝化產物的方法(文獻7：D.A.Richards，M.A.Silva，Anal.Biochem.2006，351，77)。上述方法中采用熒光分子探針的方法是一種簡單、靈敏且特異的分析方法，到目前為止，已有幾種熒光分子探針被成功用于ONOO^-的測定，如二氯二氫熒光素(DCFH)和二氫羅丹明(DHR)(文獻8：H.Possel，H.Noack，FEBS?Lett.1997，416，175；文獻9：N.W.Kooy，J.A.Royall，Free?Radic.Biol.Med.1994，16，149)，該方法雖有較高的靈敏度，但此類探針特異性較差，其它的生物氧化劑如次氯酸、巰基及過氧化酶也能氧化DCFH和DHR生成強熒光發光的二氯熒光素和羅丹明。近年來，兩種基于芳環硝化和酮類氧化反應的新型ONOO^-熒光探針：NiSPYs和HKGreens，先后被合成了出來(文獻10：T.Ueno，T.Nagano，J.Am.Chem.Soc.2006，128，10640；文獻11：D.Yang，H.Wang，J.Am.Chem.Soc.2006，128，600；文獻12：Z.Sun，H.Wang，D.Yang，Org.Lett.2009，11，1887)，這兩種探針可以與ONOO^-發生特異性反應而導致熒光強度的顯著增強，但探針水溶性較差、易被光漂白、Stokes位移小，而且細胞內保留時間短，不利于細胞內過氧亞硝酸陰離子的長期觀察和痕量測定。另外，目前已有的ONOO^-熒光探針都以熒光強度作為表征參數，雖然其操作簡單，但是其結果的精確性卻容易受外部環境和儀器條件變化如光學路徑、光漂白、散射和背景光等因素的影響。而比率熒光法能較好地解決這些問題，該法是通過測量兩個不同波長處的熒光強度，以其比值作為表征參數的一種測定方法，與傳統的熒光探針相比，比率型熒光探針一般具有更高的選擇性和靈敏度(文獻13：H.Li，H.Yan，J.Phys.Chem.C?2009，113，7526)。