[發明專利]人ski基因真核表達載體、制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201010106424.8
• 申請日: 2010-02-05
• 公開（公告）號: CN101818171A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發明（設計）人: 周元國;李平;彭艷;趙曉光;劉蘋;熊仁平;陳磊;陳星云;趙艷;寧亞蕾;楊楠
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學野戰外科研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/12;C12N15/66;A61K48/00;A61P17/02
• 代理公司: 重慶志合專利事務所 50210
• 代理人: 胡榮琿

技術領域

本發明涉及一種真核表達載體，尤其涉及人ski基因真核表達載體、制備 方法及應用。

背景技術

組織修復、創傷愈合是由于外傷或其他因素造成皮膚等組織缺損后，局部 組織通過再生、重建進行修補恢復的一系列病理生理過程。目前眾多的促修復 和愈合措施中，生長因子的應用最有代表性，如TGF-β，bFGF等，但是其強烈 的有絲分裂原活性在促進傷口愈合同時可帶來膠原分泌旺盛，造成瘢痕過度增 生和愈合質量的下降，限制了其在臨床的應用；而在目前的瘢痕治療中，主要 是針對于已形成的瘢痕的治療，如手術、加壓、放射、類固醇注射、干擾素、 硅酮及激光等方法(周元國.加強創傷耐受性差異的分子基礎研究，促進分子創 傷學的發展.創傷外科雜志2002：4(5)：257-259)，這些方法大都治療效果不 好，有的副作用很大甚至影響修復和愈合。因此，尋求新的促修復分子，既能 正向加速修復細胞增殖、促進愈合，又能降低膠原合成、負向調節瘢痕的形成， 使兩個矛盾的過程協調統一，對促進創傷愈合尤其是放創復合傷、大面積創傷、 燒傷等難愈傷口愈合和具有纖維化傾向的組織修復，降低瘢痕形成，改善修復 質量有著十分重要的意義。

ski是一種鳥類癌基因v-ski的細胞內同源物，首先發現于禽類動物(Li?Y， Turck?CM，Teumer?JK，et?al.J?Virol.1986；57(3)：1065-72)，在不同類型 的組織和細胞中分布廣泛。ski參與促進神經系統發育、造血細胞的增殖和分化、 肌肉、肝分化及再生等作用(Mizuide?M，Hara?T，Furuya?T，et?al.J?Biol?Chem. 2003；278(1)：531-6)。過去幾年，我們在國際上首先發現ski基因是一種新的 創傷修復相關基因(Liu?X，Zhang?E，Li?P，et?al.Wound?Repair?Regen.2006； 14(2)：163-172)，具有促愈合和減輕瘢痕形成的雙重作用，ski基因的這一應用 前途已公開于公開日為2005年01月12日的第ZL?200410022266.2號專利中。 但是此質粒結構較為復雜并且沒有用于人體實驗的報道，因此其是否適用于臨 床基因治療還存在著很多未知的問題。為了便于臨床實驗和研發基因治療藥物， 需要構建使用方便、安全的Ski真核表達質粒。

pUC118結構簡單，除含有1個氨芐青霉素抗性基因(Ampr)外，還有1個插 入失活的lacZ基因、自身復制起始位點和多克隆位點，具有臨床使用方便、應 用安全的特點，國外已有成功將其應用與臨床的報道。因此，我們以pUC118質 粒為載體，酶切連接目的基因、CMV啟動子等構建pUC118-Ski真核表達質粒。

發明內容

本發明的目的在于構建一種能在皮膚組織和其它組織中表達的人ski基因 表達載體，其可以作為一種基因藥物，直接進行傷口周圍局部注射(或靜脈注 射)、涂敷，使其在損傷組織長期、穩定、特異表達，應用于皮膚、食道、腸道 等上皮組織和其他組織、器官損傷，尤其是放創復合傷、大面積創傷、燒傷、 慢性潰瘍和褥瘡等難愈傷口以及各種疤痕的預防和治療，以取得較傳統藥物 更好的療效。

本發明所述的人ski基因真核表達載體，其包含載體pUC118片段和人ski 基因片段。

其中，所述人ski基因片段為SEQ?ID?NO：3序列，由SEQ?ID?NO：1-2所示 核苷酸的引物從人皮膚原代成纖維細胞(來自臨床包皮過長患者，經患者同意) 總RNA中擴增獲得。

本發明所述的人ski真核表達載體，具有CMV啟動子和BGH終止子。

本發明還提供所述的人ski基因真核表達載體的制備方法，其主要包含步 驟：

1)通過PCR從人包皮培養原代成纖維細胞總RNA中獲得人ski基因片段；

2)步驟1)獲得的人ski基因序列經HindIII和XhoI雙酶切后插入pUC118 質粒中獲得載體pUC118片段；

其中步驟1)中應用的擴增引物為SEQ?ID?NO：1-2所示的核苷酸；步驟2) 還包含在pUC118質粒上插入CMV啟動子和BGH終止子。

本發明所述的人ski基因真核表達載體可以應用于制備促進組織修復、傷 口愈合及抑制瘢痕形成的制劑。

本發明還提供促進組織修復、傷口愈合及抑制瘢痕形成的制劑，其包含上 述的人ski基因真核表達載體。

所述制劑為注射液、乳劑、霜劑、膏劑或噴霧劑。