[發明專利]一種低溫堿性磷酸酶及其制備方法

有效

• 申請號: 201010102792.5
• 申請日: 2010-01-28
• 公開（公告）號: CN102140444A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發明（設計）人: 丁澦;陸致晟
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/70
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 吳桂琴;包兆宜

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及一種DNA序列。具體而言，本發明涉及一種存在于南極細菌株TAB5的堿性磷酸酶Alkaline?Phosphatase(TAB5-AP)，還涉及該酶在大腸桿菌表達系統中的表達和純化蛋白的方法。

背景技術

堿性磷酸酶是廣泛存在于各種生物體中的非特異性酶，在生物體中具有重要作用。大多數堿性磷酸酶均是一個兩個相同的亞基組成的同型二聚體，在酶的中間部分有10組β折疊的保守序列。堿性磷酸酶作為實驗室普遍使用的一種酶，常用于在分子克隆中非特異性地脫磷酸基團，減弱來自空載體或重組載體的環境。被磷酸酶處理過的片段缺少5’的磷酰基標志，因此能夠避免自我環化，降低合成時環境方向性的影響。該酶可經加熱滅活完全去除，另外作為限制酶時在所有緩沖液中都有活性，所以被廣泛應用于科學研究中。此外，堿性磷酸酶作為一項重要的生理健康指標，在臨床醫學上有著較大的重要性。目前國內外均有對醫學檢測堿性磷酸酶指標的研究。

目前堿性磷酸酶在科學研究及臨床應用中已經起著不可替代的作用。并隨著實驗的需要逐步被改進。一個好的堿性磷酸酶不僅能夠縮短實驗周期、化簡實驗步驟，同時能增加基因克隆實驗的效果。該酶可經加熱滅活去除，另外作為限制酶時在所有緩沖液中都有活性。目前研究最多、應用范圍最廣的是從蝦中提取的堿性磷酸酶Shrimp?Alkaline?Phosphatase。但該酶的獲取成本較高，而且容易在反應中逐漸失活。另一種酶Calf?Intestinal?Alkaline?Phosphotase不能熱失活，故容易引起實驗失敗，影響研究進度。目前研究最多、應用范圍最廣的是從蝦中提取的堿性磷酸酶：Shrimp?Alkaline?Phosphatase(SAP)。該堿性磷酸酶的DNA序列和晶體結構已經被揭示，相關蛋白質功能的研究成果也陸續發表。SAP與外切核酸酶一起，為DNA測序或基因分型前從PCR產物中去除核苷酸和引物提供了最簡單、最安全和最高效的方法。但該酶的獲取成本較高，而且容易在反應中逐漸失活。另一種也廣泛使用的酶Calf?Intestinal?Alkaline?Phosphotase(CIAP)不能熱失活。因此需要尋找更好的酶進行替代。

發明內容

本發明的目的是為了克服現有堿性磷酸酶的不足，選取已公布的、證明具有良好失活特性的低溫堿性磷酸酶TAB5-AP，根據原核表達系統中的大腸桿菌密碼子偏愛理論，重新設計了該酶的DNA序列，從而提高該酶在原核系統中的表達以及在純化流出中的效果。

本發明在現有磷酸酶TAB5-AP的cDNA序列前加上了10個組氨酸的DNA序列。組氨酸能夠特異性的與鎳柱結合，幫助蛋白純化。根據大腸桿菌對氨基酸三聯密碼子的第三位堿基的特定偏愛，對該氨基酸的密碼子進行同義突變，將第三位堿基替換成大腸桿菌偏愛的堿基，修改了TAB5-AP的原始序列。當該序列的核苷酸序列在原核系統中表達時，由于大腸桿菌對替換的密碼子具有偏好，從而能夠提高蛋白的表達效率，提高目的蛋白在大腸桿菌體內的表達產量。

本發明提供了一種低溫堿性磷酸酶的制備方法，即將如序列表SEQ?ID?NO?1所示的低溫堿性磷酸酶的cDNA序列克隆到基因工程載體，表達，獲得低溫堿性磷酸酶。

本發明對現有的低溫堿性磷酸酶TAB5-AP的DNA序列的密碼子進行了優化，優化改進的內容：

1)依據大腸桿菌的密碼子偏好理論，對氨基酸三聯密碼子的第三位堿基進行了同義替換。

2)依據大腸桿菌存在的多密碼子偏好，同一核苷酸位點存在多個堿基替換。

還可以在序列N端和(或)C端能夠根據需要接上不同的蛋白標簽。較好的，在該酶cDNA的N端帶有10個組氨酸的DNA序列片段，以便于純化分離。組氨酸片段的長短和在N端和(或)C端的位置能夠根據具體情況進行調整。

本發明的低溫堿性磷酸酶的表達在室溫或低溫下進行，從而節省了能源和制備成本。得到純化的蛋白溶液，其中蛋白純度99.0％。每升菌液得到蛋白90mg以上。

具體而言，首先，合成如序列表SEQ?ID?NO?1所示的低溫堿性磷酸酶的cDNA序列，即本發明的低溫堿性磷酸酶的核苷酸編碼序列；然后，利用基因工程方法在18～25℃誘導表達過夜；最后，分離純化低溫堿性磷酸酶。

其中，合成低溫堿性磷酸酶的核苷酸編碼序列時，可以逐個添加，也可以先合成若干小片段，然后再將這些片段按照SEQ?ID?NO?1連接。