[發明專利]一種微量植物鮮樣中茉莉酸和茉莉酸甲酯的檢測方法

無效

• 申請號: 201010101062.3
• 申請日: 2010-01-26
• 公開（公告）號: CN102135528A
• 公開（公告）日: 2011-07-27
• 發明（設計）人: 肖浪濤;藺萬煌;童建華;黃志剛;李合松
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: G01N30/72
• 分類號: G01N30/72
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及測定方法，是一種針對微量植物鮮樣中茉莉酸(JA)和茉莉酸甲酯(MeJA)含量的檢測方法。

背景技術

茉莉酸類化合物包括JA、MeJA以及其它衍生物是廣泛存在于植物體內的植物生長調節物質。JA作為一類植物激素已得到國際學術界的公認，具有誘導植物防御基因的表達，誘導多種次生代謝物的合成，抑制光合作用，促進呼吸作用、氣孔關閉、葉片衰老脫落以及果實成熟等廣泛的生理功能。近年來研究表明JA是植物受外界刺激后反應最快的信號分子，也是信號途徑中的關鍵信號分子。目前植物中JA的研究已成為熱點，而JA含量的測定則是限制JA研究的技術瓶頸。

JA和MeJA在植物組織中含量極微，揮發性很強，增加了對其進行提取和分析的困難，要求分析手段具有很高的靈敏度和選擇性。Albrecht等(1993)運用酶聯免疫法測定了JA的含量，Baldwin等(1997)用氨丙基柱純化樣品，通過GC-MS技術測定了傷誘導植物中JA的含量。酶聯免疫法準確性較差，氨丙基柱不易回收利用，成本高。因此，急需采用微量植物樣品中JA和MeJA的提取純化和測定新技術。

發明內容

本發明是克服原有檢測技術中對樣品需求量大，且操作繁瑣、檢測時間過長的不足，提供一種微量植物鮮樣中的JA和MeJA的檢測方法。本發明用于對微量植物鮮樣中JA和MeJA的檢測，具有分析成本低，分析速度快，靈敏度高，且有較好的可重復性和選擇性，能夠較好的分離和獲得JA和MeJA的檢測峰，同時簡化提取和純化的步驟。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案主要包括如下步驟：1)制備JA和MeJA的提取純化的反向碳十八固相萃取柱；2)采用固相萃取柱法提取和純化植物鮮樣中JA和MeJA；3)樣品檢測：植物樣品提取純化后，LC-MS-MS檢測其JA和MeJA含量。

本發明所確定的固相萃取法為植物鮮樣中JA和MeJA提取純化最佳方法。所述的JA和MeJA的提取純化的固相萃取柱的制備，取內徑為5.6mm的SPE柱體，放入聚乙烯篩板后，添加反向碳十八填料，平衡柱子后即可。所述的固相萃取柱法分離、純化植物鮮樣中JA和MeJA，樣品置于離心管中冰浴研磨，加入600μL?100％的甲醇浸提過夜，4800g離心10min，取上清，剩余殘渣用200μL?100％的甲醇浸提2h，4800g離心10min，取上清，合并兩次上清液。用3000μL超純水稀釋，過固相萃取柱，用200μL?20％甲醇和250μL?30％甲醇分別洗脫后，用300μL?100％甲醇洗脫并收集茉莉酸及茉莉酸甲酯。所述的LC-MS-MS檢測樣品中JA和MeJA含量，主要碎片離子為m/z?133(JA)，m/z151(MeJA)，所述的色譜保留時間分別為16.27min和17.19min。

本發明的檢測原理：本發明中提取純化方法——固相萃取法，采用固相萃取柱作為分離媒介，通過小柱中的填料吸附目的物，采用梯度洗脫的方式，可以有效的去除雜質而保留目的物，并使樣品回收率和重現性得到保障。本發明采用的串聯質譜(LC-MS-MS)檢測限可?達0.03PPb(JA)和0.075PPb(MeJA)，能夠檢測到微量樣品中極低的JA和MeJA含量，且分離效果明顯好于HPLC，且HPLC需要較多量的樣品才能檢測到樣品中的JA和MeJA，因此，在很難獲得大量植物樣品(如擬南芥突變體等植物材料)的情況下，利用本發明建立的固相萃取法分離和串聯質譜法檢測就可解決這一難題。

本發明的效果是：利用本發明對微量植物樣品中的JA和MeJA的提取純化液進行LC-MS-MS分析，在20min中內可以完成測定，檢測限可達0.03PPb(JA)和0.075PPb(MeJA)，本法與HPLC法檢測結果一致。本文對36例擬南芥突變體材料、127例水稻樣品材料等的檢測表明，本方法獲得的結果符合要求。本方法介紹的串聯質譜檢測是一種快速可靠的方法。測定的條件經優化后，測定時間僅需要20min，預計測定成本100元左右，與HPLC法檢測相比，檢測時間縮短30-40min，成本卻基本一致，而且步驟也簡化了很多。

附圖說明

圖1是本發明不同提取純化方法的比較圖，圖中A、B、C、D分別代表標準品，乙酸乙酯萃取法，二氯甲烷萃取法，固相萃取柱法。

圖2是本發明的串聯質譜檢測新方法與高效液相色譜法測定樣品中JA和MeJA結果的比較，上圖為串聯質譜圖譜，下圖為高效液相色譜圖譜。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步描述。

一.試劑與儀器