[發(fā)明專利]食品中四種致敏原麩質(zhì)成分實時熒光PCR檢測引物和探針、試劑盒及檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010100428.5
• 申請日: 2010-01-21
• 公開（公告）號: CN101724707A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹際娟;鄭秋月;徐君怡
• 申請（專利權(quán)）人: 曹際娟;鄭秋月;徐君怡
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責(zé)任公司 21212
• 代理人: 劉曉琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及食品致敏原成分的基因檢測方法。尤其是食品致敏原麩質(zhì)成分 的實時熒光PCR檢測方法及其中所涉及的特異性引物、探針和相關(guān)試劑盒。

背景技術(shù)

食品成分中存在的天然致敏原成分會引起6％～8％的兒童和2％的成人的過 敏反應(yīng)，嚴重的會危及生命。其中，麩質(zhì)是大麥、小麥、燕麥、黑麥等糧食中 存在的天然成分，也是最主要、最常見的致敏原成份之一。麩質(zhì)是谷物特別是 小麥中的一組蛋白質(zhì)。小麥與黑麥、大麥，還有燕麥十分相近。因此這些谷類 也含有麩質(zhì)。麩質(zhì)使面團具有堅固的結(jié)構(gòu)。在面包加工時的醒發(fā)過程中麩質(zhì)蛋 白形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，如果沒有麩質(zhì)就不能形成這樣的結(jié)構(gòu)，面包也就不能發(fā)酵。對 于大多數(shù)人來說麩質(zhì)是很普通的蛋白質(zhì)，容易被胃腸道消化。然而少部分人卻 不能消化麩質(zhì)蛋白。這些人有麩質(zhì)蛋白不適應(yīng)癥——最常見的病癥是乳糜瀉。 麩質(zhì)是一系列單一蛋白質(zhì)的混合物，這些蛋白質(zhì)可被劃分為兩組——醇溶谷蛋 白和谷蛋白。主要的醇溶谷蛋白，也就是麩朊，似乎是乳糜瀉或麩質(zhì)蛋白不適 應(yīng)癥的主要原因，通常在患有這種病癥的免疫體中能夠發(fā)現(xiàn)麩朊抗體?；加羞@ 種疾病的人食用含有麩質(zhì)蛋白的食物時，他們的免疫系統(tǒng)就會通過損害小腸來 做出反應(yīng)。特別是對小腸內(nèi)層的茸毛的破壞。食物中的營養(yǎng)成分都是經(jīng)過這些 茸毛被吸收并進入血液循環(huán)的，沒有它們的幫助，不管吃進去多少食物，人都 會營養(yǎng)不良。因為人體自身免疫系統(tǒng)造成的損害，乳糜瀉被認為是自身免疫功 能紊亂，也可以看作是一種吸收障礙性疾病，因為營養(yǎng)物質(zhì)不能被吸收。乳糜 瀉還被稱為自發(fā)性吸收不良綜合癥、非熱帶性口炎性腹瀉和谷蛋白敏感性腸病。 該疾病無法治愈，但避免食用麩質(zhì)可以消除其癥狀，減輕并可能逆轉(zhuǎn)其損害， 并降低相關(guān)的健康風(fēng)險。為了確?；加腥槊訛a的人獲得應(yīng)有的警示和不被誤導(dǎo)， 以及為食品的“無麩質(zhì)”類標簽的使用提供真實和準確的信息，準確嚴格的檢 驗方法是必不可少的。

目前針對食品致敏原的檢測方法，主要有體內(nèi)檢測的皮膚試驗和雙盲安慰 劑對照激發(fā)試驗，體外檢測的血清I，試驗和組胺釋放試驗、PCR檢測等。傳 統(tǒng)的體內(nèi)檢測試驗直接檢測是否存在過敏蛋白質(zhì)，由于過敏蛋白質(zhì)通常痕量存 在而被食品基質(zhì)掩蓋，造成試驗結(jié)果假陰性。DNA比蛋白質(zhì)更耐受熱處理和壓 力作用，尤其是對于一些過敏原很難獲得相應(yīng)的血清抗體。PCR方法中，在熱 變性條件下目標DNA可以有效提取而不像蛋白提取時受食物基質(zhì)的影響較大， 它的另一個優(yōu)點是穩(wěn)定性，不像蛋白質(zhì)組成那樣受地理條件和季節(jié)變化的影響。 但是常規(guī)的PCR特異性較低，且存在污染問題。

實時熒光PCR技術(shù)于1996年由美國Applied?Biosystems公司推出，它通過 在PCR擴增過程中檢測產(chǎn)物的熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程。由于該技 術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異準 確、可有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已廣泛應(yīng)用于各種 基因的檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的即在于提供方便、快速、靈敏地定量檢測食品中致敏性麩質(zhì) 成分的實時熒光PCR方法，以及檢測中所使用的包含特異性引物及探針序列的 試劑盒。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供食品中四種致敏原麩質(zhì)成分實時熒光 PCR檢測引物和探針，它們分別是：

①大麥(Barley)Hordein基因的檢測引物和探針序列：

正向引物(SEQ?ID?NO.1)：5′-AACAGCTAAACCCATGCAAGGTA-3′，

反向引物(SEQ?ID?NO.2)：5′-GTTCGGGGATTTGGGGTAGTTG-3′，

探針(SEQ?ID?NO.3)：

5′-FAM-TCCTCCAGCAGCAGTGCAGCCCT-Eclipse-3′；

②小麥(Wheat)Gliadin基因的檢測引物和探針序列：

正向引物(SEQ?ID?NO.4)：5′-CCCAAAGTACGACGCAACGAC-3′，

反向引物(SEQ?ID?NO.5)：5′-GGATTCGGTTATGCCTTCGTG-3′，

探針(SEQ?ID?NO.6)：

5′-FAM-CATGCCGACACACATCAAGGTTGAC-Eclipse-3′；

③黑麥(Rye)Sec1基因的檢測引物和探針序列：