[發(fā)明專利]LCMV-GP-VSV假型載體和腫瘤浸潤性的病毒生產(chǎn)細(xì)胞用于腫瘤的治療

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980146679.2
• 申請日: 2009-10-08
• 公開（公告）號: CN102224248A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 多蘿特·馮·萊爾;薩南·黑曼
• 申請（專利權(quán)）人: 多蘿特·馮·萊爾
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;A61K35/76;C12N5/10;C12N5/074
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會專利商標(biāo)事務(wù)所 11038
• 代理人: 羅菊華

本發(fā)明涉及衍生自水泡性口炎病毒(VSV)的重組病毒和病毒載體其包含編碼淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因，涉及產(chǎn)生GP-LCMV-假型化VSV病毒粒子的包裝細(xì)胞，并涉及所述病毒粒子和包裝細(xì)胞用于制備用于治療實(shí)體腫瘤的藥物組合物的用途。

背景技術(shù)

惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤(原生顱內(nèi)腦瘤的最大的組)代表至今未解決的治療問題。雖然通過高強(qiáng)度的基礎(chǔ)研究，對此類腫瘤的生物學(xué)的理解已增長，臨床過程和預(yù)后仍然很差。

惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)上皮起源的腫瘤并且在細(xì)胞學(xué)上被劃分為室管膜瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、寡星狀細(xì)胞瘤、星狀細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。彌漫浸潤性星狀細(xì)胞瘤(WHO級別II-IV)具有超過60％的比例，組成了顱內(nèi)腫瘤的最大的組。于2001年修訂的WHO分類被最廣泛地作為星狀細(xì)胞瘤的分級方案。根據(jù)WHO，介由組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)將腦瘤分為4種惡性級別(Kleihues和Cavenee，2000)。彌漫浸潤性星狀細(xì)胞瘤的預(yù)后通常不良。預(yù)后一方面取決于惡性級別，另一方面取決于腫瘤的位置和治療方法。對于具有星狀細(xì)胞瘤WHO級別II的患者，平均存活時間多于5年；對于具有星狀細(xì)胞瘤WHO級別III的患者，平均存活時間為2-5年；而對于具有WHO級別IV的星狀細(xì)胞瘤-膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(＝膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)的患者，平均存活時間少于1年。

腫瘤的分子學(xué)發(fā)病機(jī)理是復(fù)雜的過程并且是由于負(fù)責(zé)控制細(xì)胞周期的不同基因的突變而產(chǎn)生的。腫瘤抑制因子基因p53中的突變是人類腫瘤中最常發(fā)現(xiàn)的改變并且既負(fù)責(zé)低級別星狀細(xì)胞瘤的出現(xiàn)也負(fù)責(zé)向繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)展。原發(fā)出現(xiàn)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤反而很罕見地具有p53突變。另一個指示彌散性星狀細(xì)胞瘤的惡性趨勢的基因被懷疑在染色體19的長臂上。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的情形中其他經(jīng)常被改變的基因是致癌基因MDM2和MDM4以及腫瘤抑制因子基因p14ARF，在細(xì)胞周期的p53依賴性控制中涉及它們(Dai和Holland，2001)。在30-40％的原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中觀察到了EGF受體基因的擴(kuò)增，因此其是此腫瘤組中最常被擴(kuò)增的致癌基因(Holland，2001)。大多數(shù)惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤對化學(xué)或放射療法的響應(yīng)不良。其原因被懷疑是細(xì)胞周期相關(guān)基因的突變，所述基因也參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

因?yàn)閺默F(xiàn)存的治療方法(例如化學(xué)或放射療法)不再期待疾病預(yù)后的顯著改善，亟需用于惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的更有效的治療方法。而膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的基因治療提供了有希望的可能性，所述可能性需被開發(fā)。為此目的，已開發(fā)了多個不同的、非常有效的基因。對于其中的大多數(shù)，也存在動物實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)(Shir和Levitzki，2001)。這些治療性基因可被劃分為四種不同的作用原理：

(i)所謂自殺基因的基因產(chǎn)物將前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性分子。實(shí)例是單純皰疹病毒(HSV)的胸苷激酶(TK)，與更昔洛韋的給藥相結(jié)合。特別的優(yōu)勢是有毒的更昔洛韋三磷酸鹽擴(kuò)散到臨近的細(xì)胞中，從而產(chǎn)生“旁觀者(bystander)”效應(yīng)。近年來，此酶的所述活性被進(jìn)一步提高了。目前HSV?TK是清除腫瘤細(xì)胞以及植入的載體產(chǎn)生細(xì)胞的很有效的可能性。

(ii)免疫刺激性細(xì)胞因子(例如IL-4)在腫瘤中的表達(dá)可刺激抗腫瘤細(xì)胞的天然防御。

(iii)抗血管生成蛋白(例如內(nèi)皮他丁)的分泌引起血管的缺少，并因此引起代謝上非常活躍的腫瘤組織中營養(yǎng)供給的缺少。腫瘤實(shí)際上在經(jīng)受饑餓。

(iv)最后，描述了一系列基因，其參與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而抑制所述細(xì)胞的不受控生長。然而，這些基因在臨床中的應(yīng)用可能性是受限的，因?yàn)檫@些基因僅在經(jīng)基因修飾的細(xì)胞自身中起作用，而不產(chǎn)生如所述第一個作用原理的“旁觀者”效應(yīng)。這意味著為了實(shí)現(xiàn)治療效果，實(shí)際上所有的惡性細(xì)胞均需經(jīng)過遺傳修飾，而即使使用理想的載體系統(tǒng)，這也是沒有希望的。

多個現(xiàn)存的、非常有效的作用原理產(chǎn)生了對于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的成功的基因治療而言最重要的前提條件。然而，至此仍未解決的問題是至今低效的基因轉(zhuǎn)移和治療性基因在靶細(xì)胞中的不良表達(dá)。這也是為什么盡管有許多有效的治療性基因，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的基因治療仍在臨床中失敗。

病毒的基因轉(zhuǎn)移相比于物理化學(xué)轉(zhuǎn)染方法的優(yōu)勢是更高的基因轉(zhuǎn)移率和基因的更長期表達(dá)，因?yàn)椴《景l(fā)展了特別有效的機(jī)制來將其基因組引入細(xì)胞中并進(jìn)行表達(dá)。作為溶瘤病毒(OV)，目前特別使用的是能夠復(fù)制的病毒，例如單純皰疹病毒(HSV)、腺病毒(Ad)、新城疫病毒(NDV)、呼腸病毒和水泡性口炎病毒(VSV)。對于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的最佳病毒治療而言，OV應(yīng)具有下列特征：