[發(fā)明專利]通過終止密碼子連讀的多肽同種型的細(xì)胞表面展示

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980142651.1
• 申請日: 2009-08-28
• 公開（公告）號: CN102197136A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: T·約斯多克;H-P·科諾普夫;A·J·諾梅;B·威爾姆斯
• 申請（專利權(quán)）人: 諾瓦提斯公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/62
• 代理公司: 北京市中咨律師事務(wù)所 11247
• 代理人: 凌立;黃革生

1.用于選擇至少一個表達(dá)希望水平目的多肽的真核宿主細(xì)胞的方法，其包括：

a)提供多個包含異源核酸的真核宿主細(xì)胞，所述異源核酸包含至少一個盒(Cas-POI)，所述盒(Cas-POI)至少包含編碼目的多肽的第一多核苷酸(Pn-POI)、至少一個處于所述第一多核苷酸下游的終止密碼子，和處于所述終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸；

b)培養(yǎng)所述真核宿主細(xì)胞，以允許表達(dá)目的多肽，使得至少部分目的多肽表達(dá)為包含所述免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的融合多肽，其中所述融合多肽展示在所述宿主細(xì)胞表面；

c)根據(jù)展示在細(xì)胞表面的融合多肽的存在或量選擇至少一個真核宿主細(xì)胞。

2.用于以高產(chǎn)率產(chǎn)生目的多肽的方法，所述方法包括：

a)提供多個包含異源核酸的真核宿主細(xì)胞，所述異源核酸包含至少一個盒(Cas-POI)，所述盒(Cas-POI)包含編碼目的多肽的第一多核苷酸(Pn-POI)、至少一個處于所述第一多核苷酸下游的終止密碼子，和處于所述終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸；

b)培養(yǎng)所述真核宿主細(xì)胞，以允許表達(dá)目的多肽，使得至少部分目的多肽表達(dá)為包含所述免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的融合多肽，其中所述融合多肽展示在所述宿主細(xì)胞表面；

c)根據(jù)展示在細(xì)胞表面的融合多肽的存在或量選擇至少一個真核宿主細(xì)胞；

d)在允許表達(dá)目的多肽的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選擇的真核宿主細(xì)胞。

3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述盒(Cas-POI)的表達(dá)產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物，所述轉(zhuǎn)錄物至少包含：

-第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸的翻譯產(chǎn)生目的多肽；

-至少一個處于所述第一多核苷酸下游的終止密碼子；

-處于所述終止密碼子下游的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸的翻譯產(chǎn)生免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體；

其中至少部分轉(zhuǎn)錄物通過所述至少一個終止密碼子的翻譯連讀翻譯為包含所述免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的融合多肽。

4.權(quán)利要求1至3中至少一項(xiàng)的方法，其中所述免疫球蛋白跨膜錨選自：

a)衍生自IgA、IgE、IgM、IgG和/或IgD的跨膜錨；

b)包含胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白跨膜錨；

c)包含SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6和/或SEQ?ID?NO：7中所示的序列的免疫球蛋白跨膜錨；和

d)前述的功能性變體，其允許將所述融合多肽錨定在真核宿主細(xì)胞表面。

5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中步驟c)包括使多個真核宿主細(xì)胞與結(jié)合所述融合多肽的檢測化合物接觸，并根據(jù)結(jié)合的檢測化合物的存在或量選擇至少一個真核宿主細(xì)胞。

6.權(quán)利要求1至5中至少一項(xiàng)的方法，其中終止密碼子連讀產(chǎn)生約≤50％、≤25％、≤15％、≤10％、≤5％、≤2,5％、≤1,5％、≤1％或少于≤0,5％的融合多肽。

7.權(quán)利要求1至6中至少一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)行兩個或多個選擇周期，其中在每個選擇周期中，根據(jù)展示在細(xì)胞表面的融合多肽的存在或量選擇至少一個真核宿主細(xì)胞。

8.權(quán)利要求1至7中至少一項(xiàng)的方法，其中通過流式細(xì)胞術(shù)檢測所述檢測化合物與真核宿主細(xì)胞表面的接觸。

9.適用于在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)至少一種目的多肽的載體核酸，其包含：

a)至少一個盒(Cas-POI)，其包含用于編碼目的多肽的第一多核苷酸(Pn-POI)的插入位點(diǎn)，和/或編碼目的多肽的第一多核苷酸；

b)至少一個處于所述插入位點(diǎn)下游和/或所述第一多核苷酸下游的終止密碼子；和

c)處于所述終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸。

10.權(quán)利要求9的載體核酸，其包含至少一個以下特征：

-盒(Cas-POI)中編碼目的多肽的第一多核苷酸(Pn-POI)；

-包含哺乳動物選擇標(biāo)記基因的表達(dá)盒(MSM)；和/或

-包含哺乳動物可擴(kuò)增選擇標(biāo)記基因的表達(dá)盒(MASM)。