[發明專利]G6PC2編碼的β細胞表面標簽

無效

• 申請號: 200980139608.X
• 申請日: 2009-09-30
• 公開（公告）號: CN102171242A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發明（設計）人: B·羅普;J·哈爾德;O·D·馬德森
• 申請（專利權）人: 諾沃-諾迪斯克有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K14/705;C12N5/071
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 梁謀;郭文潔

發明領域

本發明涉及選擇性細胞表面標記，其是由G6PC2編碼的胰島特異性葡糖-6-磷酸催化亞基相關蛋白(IGRP)的胞外部分，并且可供選擇和定量測定包含完全分化的胰腺內分泌β細胞表型的細胞的獨特亞群。在一個實施方案中，G6PC2編碼的β細胞表面標簽是剪接變體。還包括其序列、組合物、細胞培養物和完全分化的β細胞的細胞群體以及產生完全分化的β細胞和檢測完全分化的β細胞的方法。

發明背景

β細胞移植對改進1型糖尿病的治療有著巨大前景，但是首先需要克服許多障礙。其中之一是缺乏可利用的供體胰島。胚胎干(ES)細胞衍生的β細胞基本上可以供應無數的β細胞用于移植，但是還未開發出用于產生完整功能的β細胞的可靠方案。對于小鼠和人ES細胞兩者，在例如WO?2005/116073、WO?2005/063971和US?2006/0148081中報道了由胚胎干細胞形成的定型內胚層(DE)細胞。由例如DE細胞有效地形成胰內胚層(PE)細胞對形成用于治療糖尿病的產胰島素β細胞是有利的。

在培養完全分化的胰島細胞的嘗試中，目標一直是分離胰細胞，包括能夠分化成胰β細胞或胰島的胰內分泌先祖細胞。從外分泌譜系分離胰內分泌譜系的一個重要步驟可能是鑒定可識別的對胰內分泌先祖細胞和/或其子代有特異性的細胞標記，特別是對成熟的產胰島素的β細胞有特異性的標記。為此對胞內和胞外標記兩者進行了研究。已經對胞內標記，特別是對在發育成完全分化的胰島細胞的胚胎胰細胞中檢出的轉錄因子作為祖代標記進行了廣泛的研究。例如，對Pdx-1、Ngn3、Pax6和Isl-1等轉錄因子進行了研究。它們在胚胎發育成胰內分泌細胞期間進行編程的細胞中表達。然而，這些胞內標記提供比胞外標記少的實用價值，因為分析這些標記的表達需要殺死細胞或將報道基因經遺傳工程改造至細胞中而對細胞進行永久修飾。

一經鑒定，胞外標記可提供優勢，使得表達標記的細胞可在無菌條件下進行分選并繼續生存。已對作為胰島祖代標記的上皮細胞黏著分子(例如Ep-CAM和整聯蛋白)進行了研究。

附圖簡述

圖1表示全長人G6PC2編碼的肽的整體組構--表示跨膜序列段以及5個ER腔結構域和5個胞質結構域。外顯子-外顯子間的邊界用灰色圓圈和箭頭標注。預測包含活性中心的氨基酸殘基用實心黑色圓圈標注。殘基92-94上的Asn-聯糖基化位點用作寡糖的接納體。

圖2表示小鼠和人G6PC2編碼的肽的全長ClustalW比對。在人和小鼠蛋白質序列間的行中，相同殘基用氨基酸的一字母代碼標注，保守取代用“+”標注，非保守取代用“”標注，即空白。

發明概述

在一個實施方案中，本發明涉及由G6PC2編碼的分離肽，其中所述肽包含i)胞外部分和ii)G6PC2的一個或多個外顯子的缺失，前提條件是所述肽不是MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYTFLNFMSNVGDPRNIFFIYFPLCFQFNQTVGTKMIWVAVIGDWLNLIFKWKSIWPCNGRILCLVCHGNRCPEPHCLWDG。在一個實施方案中，本發明涉及由G6PC2編碼的分離肽，其中所述肽包含i)胞外部分，和ii)G6PC2的一個或多個外顯子的缺失以及編碼所述肽的分離核苷酸和表達所述肽的分離細胞。在一個實施方案中，本發明涉及鑒定完全分化的β細胞的方法，所述方法包括使包含胰細胞的細胞群體與結合G6PC2編碼的β細胞表面標簽的試劑接觸。

在一個實施方案中，本發明涉及獲得完全分化的β細胞的培養物的方法，所述方法包括：使包含胰細胞的細胞群體與結合G6PC2編碼的β細胞表面標簽的試劑接觸，并且將對G6PC2編碼的β細胞表面標簽呈陽性的細胞流分中的與結合G6PC2編碼的β細胞表面標簽的試劑結合的細胞從不與結合G6PC2編碼的β細胞表面標簽的試劑結合的細胞中分離出來。

在一個實施方案中，本發明涉及向在其至少一種胰腺激素產生中有缺陷的哺乳動物提供胰內分泌功能的方法，其中細胞通過本文限定的方法獲得，所述方法還包括以下步驟：將所獲得的細胞以足以在哺乳動物中產生可測量的至少一種胰腺激素的量植入哺乳動物。在一個實施方案中，所述至少一種胰腺激素是胰島素。在一個實施方案中，哺乳動物是人。

在一個實施方案中，本發明涉及通過以下步驟定量測定對G6PC2編碼的β細胞表面標簽呈陽性的包含胰細胞的細胞的方法：a)使細胞與結合G6PC2編碼的β細胞表面標簽的試劑接觸；和b)測定展示作為細胞表面標記的G6PC2編碼的β細胞表面標簽的細胞(對G6PC2編碼的β細胞表面標簽呈陽性的細胞)的量。