[發明專利]用于在植物中表達異源核苷酸序列的組合物和方法

有效

• 申請號: 200980134479.5
• 申請日: 2009-09-08
• 公開（公告）號: CN102144034A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發明（設計）人: P·E·漢默;V·貝林松;T·K·辛森
• 申請（專利權）人: 阿森尼克斯公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 黃革生;胡志君

技術領域

本發明涉及植物分子生物學領域，更具體地涉及在植物中鑒定和使用調節元件。

發明背景

植物中葉綠體的生物發生取決于位于葉綠體與細胞核中的兩個獨立的遺傳系統的協調的活動(參見Cline和Henry(1996)，Annu.Rev.Cell?Dev.Biol.12，1-26)。大量的組分葉綠體蛋白是由核基因編碼的并且是細胞質合成的-作為包含稱為轉運肽的N-端延伸的前體形式。轉運肽在特異性識別葉綠體表面并且介導前蛋白質翻譯后轉運跨過葉綠體被膜并且因此進入葉綠體內的各種不同亞區室(例如，基質、類囊體以及類囊體膜)的方面起作用。

所報告的在其N端具有自然編碼的轉運肽序列的基因包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RuBisCo)的葉綠體小亞基(de?Castro?Silva?Filho等人(1996)Plant?Mol.Biol.30：769-780；Schnell，D.J.等人(1991)J.Biol.Chem.266(5)：3335-3342)；5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等人(1990)J.Bioenerg.and?Biomemb.22(6)：789-810)；色氨酸合酶(Zhao，J.等人(1995)J.Biol.Chem.270(11)：6081-6087)；質體藍素(Lawrence等人(1997)J.Biol.Chem.272(33)：20357-20363)；分支酸合酶(Schmidt等人(1993)J.Biol.Chem.268(36)：27477-27457)；以及捕光葉綠素a/b結合蛋白(LHBP)(Lamppa等人(1988)J.Biol.Chem.263：14996-14999)，雖然并不是所有這些序列在高等植物中在葉綠體靶向蛋白的異源表達中是有用的。

發明概述

在此提供了用于植物中多肽的葉綠體靶向的組合物和方法。組合物包含表達盒，所述表達盒包含可操作地連接到感興趣的核苷酸序列上的對從藻類生物衍生的葉綠體靶向肽(或葉綠體轉運肽，“CTP”)序列進行編碼的核苷酸序列。這些表達構建體對于單子葉植物或雙子葉植物中感興趣的核苷酸序列的表達以及正確的靶向是有用的。本發明進一步提供了包含表達盒的載體、以及具有已穩定地摻入或瞬時表達在其基因組中的上述表達盒的植物和植物細胞。另外，組合物包括此類植物的轉基因種子。

還提供了用于在植物或植物細胞中表達核苷酸序列的方法，以及鑒定用于植物的藻類CTP序列的方法。

附圖說明

圖1表示TagGFP在煙草原生質體中的表達。

圖2表示在玉米細胞中衣藻(Chlamydomonas)EPSPS葉綠體轉運肽的表達以及加工。泳道1：非轉基因玉米系Hi-II；泳道2-6：用衣藻EPSPSCTP/GRG23(ace3)(R173K)構建體轉化的各個T_o轉植項；泳道7：蛋白分子量標準標記物；泳道8：純化的GRG23(ace3)(R173K)蛋白(4ng)。

圖3表示玉米中表達的經加工的衣藻EPSPS-GRG-23(ace3)(R173K)蛋白的分子量的計算。使用對數分子量對來自圖2的蛋白分子量標準品的遷移距離的圖的線性回歸來計算GRG23(ace3)(R173K)蛋白標準品以及植物提取物中檢測到的經加工的衣藻EPSPS-GRG-23(ace3)(R173K)的表觀分子量。

詳細說明

在生產轉基因植物中，將外源蛋白導向至特定的亞細胞位置(例如，葉綠體、液泡、線粒體或ER)通常是有用的。以前的工作人員已經將來自不同植物基因的編碼轉運肽的DNA序列融合到感興趣的基因上。當翻譯該基因時，得到的蛋白質具有融合到感興趣的蛋白質的氨基末端上的植物轉運肽，并且因此以不同的效率將該蛋白質導向至所希望的亞細胞的區室。

因此，本發明是針對用于在高等植物或植物細胞中多肽的葉綠體靶向的組合物以及方法。本發明的組合物包含表達盒，所述表達盒包含可操作地連接至感興趣的核苷酸序列上的對從藻類生物衍生的葉綠體轉運肽(CTP)進行編碼的核苷酸序列。在一個實施方案中，該CTP是從衣藻衍生的。在另一個實施方案中，該CTP包含SEQ?ID?NO：3、5或7中所列出的氨基酸序列或由SEQ?ID?NO：1、2、4或6所編碼的氨基酸序列，及其變體、片段以及衍生物。此外，提供了轉化的植物、植物細胞和種子。