[發明專利]結構限定的適配子的直接選擇

無效

• 申請號: 200980117250.0
• 申請日: 2009-03-12
• 公開（公告）號: CN102066562A
• 公開（公告）日: 2011-05-18
• 發明（設計）人: 菲利普·N·伯勒爾;馬克·P·邁克派克
• 申請（專利權）人: 雪城大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 張穎;樊衛民

發明領域

本發明涉及適配子及其應用領域。

相關申請的交叉引用

本申請要求下列申請的優先權：2008年3月12日提交的第61/035,844號美國臨時專利申請、2008年12月4日提交的第61/119,777號美國臨時專利申請，以上申請的全部內容在此收編作為參考。

關于聯邦政府資助研究聲明

本文所述的發明是在美國國立衛生研究院第一階段SBIR計劃提供ORTHOSYSTEMS公司的經費資助下完成的，聯邦政府可能對本發明擁有一定權利。

發明背景

適配子是以相當于抗體-抗原相互作用的親和力和特異性結合靶標的核酸或肽分子。由于不需要在動物或細胞系中進行選擇、有數年的貨架生命期、可以很容易的進行修飾以減少與非預期靶標的交叉反應性，因此DNA/RNA適配子能夠提供低成本高收益的抗體替代品。這種與靶標結合并且在某些情況下改變其靶標功能的能力，使適配子具有在生物傳感器開發、親和層析以及最近的治療和診斷中的應用潛力。

傳統上，人工適配子序列是通過SELEX技術(SYSTEMATIC?EVOLUTION?OF?LIGANDS?BY?EXPONENTIAL?ENRICHMENT，指數富集式配體系統進化技術)以及其他密切相關的體外進化方法發現的。起始文庫具有相對較長的DNA/RNA序列寡聚物(80-120NT)，其中央是隨機化區域(30-120NT)。這些是稀疏采樣文庫，其在一個典型的起始池中，隨機化30MER出現任意特定序列的概率為大約10^-4，對于隨機化70MERS出現任意特定序列的可能性是大約10^-29。這意味著此類SELEX實驗是由那些隨機存在的序列單拷貝開始的。通過與靶標結合后擴增存活體的選擇壓力使之發生進化，選擇和擴增一般要重復5-20輪。通過克隆和測序的方法找到最終的存留序列，之后，通過截去親本適配子中與靶標相互作用所不必需的片斷的方法找到一個最小核心結合序列。

盡管SELEX方法被廣泛用于發現DNA/RNA適配子，但迄今使用此方法只發現了幾百個靶標特異性的適配子，與此相比，同期篩選出的抗體有數千個。這種有限的成功可能主要源于SELEX選擇方法本身的很多缺陷。首先，在SELEX實驗中出現的各種可能的序列數量如此巨大(例如，對于30個核苷酸隨機延伸而言有1×10¹⁸種可能序列)，以致于直接合成與篩選所有序列是不可能的，即使是利用先進的高通量DNA/RNA合成儀器進行制備也是如此。其次，即使SELEX識別出對靶標具有非常高親和力的核酸序列，這些序列通常比較長(一般在80-150個單體長度單位)，而且往往具有復雜的內部結構(二級結構)。這么長的折疊分子對于各種應用而言常常是不利的，而短的(20-40個單位)限定結合結構域則在生產和操作的成本和方便上都較有優勢。第三，重復數輪進行選擇和擴增的SELEX方法是不方便的、耗時的和昂貴的。

鑒于上述原因，需要有改進的高通量的適配子發現方法。

發明概述

一種所謂的高通量適配子篩選方法(HTSA)被描述為用于快速發現以高親和力和選擇性結合靶標的相對較小、結構限定的核酸序列。

在一個方面，本發明提供了一個包含多個適配子候選物的適配子文庫。每個適配子候選物長度基本相同并且具有一級結構和預先選定的二級結構。一級結構包括至少一個其中在m個位置上的核苷酸有變化的可變核苷酸序列，二級結構包括至少一個單鏈區和一個雙鏈區，其中的可變序列至少是單鏈區的一部分，并且，其中對于每100pmol的適配子候選物而言，平均至少表現了大約三拷貝的每種可能的可變序列。

在各種實施方案中，預先選定的二級結構是發夾環、凸環、內部環、多分支環、假節結或它們的組合。

可變序列可在某些位置具有隨機化的核苷酸而在其它位置具有不變的核苷酸，或者在所有位置都具有隨機化的核苷酸。可變序列可完全在單鏈區內，或者包含位置在雙鏈區內且距單鏈區末端在三個核苷酸以下的核苷酸。

在某些實施方案中，對于每100pmol的適配子候選物而言，平均至少表現了大約六拷貝、十二拷貝或更高數目拷貝的每種可能的可變序列。m個位置的數目可至少為大約5個。每個適配子候選物可以是大約50-60個核苷酸長度，而m可以是大約25、22或更少。一個特征是每個適配子候選物具有共同的二級結構。每一適配子候選物可能包含選自DNA、RNA、PNA、修飾的核苷酸以及任何上述物質混合物的寡核苷酸。在某些實施方案中，每個適配子候選物長度在100、75或50個核苷酸以下。