[發(fā)明專利]改進的啟動子和用其產(chǎn)生L-賴氨酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980103228.0
• 申請日: 2009-01-23
• 公開（公告）號: CN103298930A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金喆河;崔宗秀;林相曹;金亨俊;文準玉;田桂恒;成珍錫
• 申請（專利權(quán)）人: CJ第一制糖株式會社
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 趙蓉民

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及改進的啟動子和用其產(chǎn)生L-賴氨酸的方法。更具體的是，本發(fā)明涉及谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium?glutamicum)來源的顯示改良啟動子活性的被可操作地連接到編碼天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脫氫酶的操縱子上的核酸分子；含有所述核酸分子的載體；所述載體被引入其中的轉(zhuǎn)化體；和利用所述轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生L-賴氨酸的方法。

背景技術(shù)

棒狀細菌是傳統(tǒng)工業(yè)微生物，其最廣泛用于各種在動物飼料、藥物和食品工業(yè)中有用的化學物質(zhì)的產(chǎn)生，包括氨基酸，如L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸、L-蘇氨酸和谷氨酸，以及核酸相關(guān)物質(zhì)。這些微生物是革蘭氏陽性的且其生長需要生物素。它們通過劈裂(snapping)分裂，它們對其產(chǎn)生的代謝物的弱降解力可被有益利用。棒狀細菌的代表性實例包括如谷氨酸棒桿菌的棒狀桿菌屬、如黃色短桿菌(Brevibacterium?flavum)的短桿菌屬、節(jié)桿菌某些種(Athrobacter?spp.)和微桿菌某些種(Microbacterium?spp.)等。

L-賴氨酸是商業(yè)上重要的L-氨基酸，由于其幫助機體吸收其它氨基酸的能力從而提高飼料質(zhì)量而被用作動物營養(yǎng)的飼料添加劑。對于機體，L-賴氨酸用作注射液成分，并且也發(fā)現(xiàn)在藥物領(lǐng)域中的應(yīng)用。因此，L-賴氨酸的工業(yè)生產(chǎn)是經(jīng)濟上重要的工業(yè)方法。

賴氨酸的產(chǎn)率與生物合成途徑中的酶活性有關(guān)，該活性一般通過擴增賴氨酸生物合成途徑中一個或多個基因或通過應(yīng)用基因的修飾的啟動子來增強。在其中賴氨酸生物合成相關(guān)基因被增強的棒狀桿菌菌株和利用其進行L-賴氨酸生產(chǎn)是熟知的。例如，美國專利號6,746,855公開了通過發(fā)酵具有增強的lysE基因(賴氨酸輸出載體基因)的產(chǎn)L-賴氨酸棒狀桿菌來產(chǎn)生L-賴氨酸的方法，其中另外地選自dapA基因、lysC基因、pyc基因和dapB基因的基因被增強。美國專利號6,221,636公開了用包含編碼天冬氨酸激酶的核苷酸序列和編碼二氨基庚二酸脫羧酶的核苷酸序列的重組DNA轉(zhuǎn)化的棒狀桿菌，在編碼天冬氨酸激酶的核苷酸序列中，L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制實質(zhì)上敏感性降低(desentitized)。

為了將棒狀細菌發(fā)展為能夠高滴度產(chǎn)生目標產(chǎn)物的變體，需要可選擇性控制涉及代謝的基因或代謝工程技術(shù)。為此，重要的是修飾啟動子的活性——為RNA聚合酶提供可靠的初始結(jié)合位點以控制被調(diào)節(jié)的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)性DNA區(qū)域。

但是，迄今沒有公開過帶有增強啟動子的棒狀細菌，該棒狀細菌在lysC-asd操縱子活性上得到改良，該操縱子在賴氨酸生物合成途徑中發(fā)揮重要作用。

發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題

本發(fā)明對L-賴氨酸的產(chǎn)生進行透徹而深入的研究，發(fā)現(xiàn)當在棒狀桿菌基因組中轉(zhuǎn)化有在特定堿基處修飾的lysC-asd操縱子啟動子時，棒狀桿菌屬微生物顯示比內(nèi)源活性改進的天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脫氫酶活性。

技術(shù)方案

本發(fā)明的目的之一是提供源于谷氨酸棒桿菌的核酸分子，其顯示改進的啟動子活性。

本發(fā)明的另一目的是提供含有核酸分子的載體，該核酸分子顯示改進的啟動子活性。

本發(fā)明另一個目的是提供在其中錨定有(anchored)載體的轉(zhuǎn)化體。

本發(fā)明還另一個目的是提供通過發(fā)酵轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生L-賴氨酸的方法。

有利效果

當源于棒狀桿菌的表現(xiàn)改良的啟動子活性的核酸分子被可操作地連接到lysC-asd基因時，根據(jù)本發(fā)明的谷氨酸棒狀桿菌比野生型啟動子顯示更高的啟動子活性，并因此可提高天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脫氫酶的水平。因此，用核酸分子轉(zhuǎn)化的賴氨酸產(chǎn)生菌株可高產(chǎn)率產(chǎn)生賴氨酸。

附圖說明

圖1是顯示整合到棒狀桿菌基因組的載體pDZ遺傳圖譜的示意圖。

圖2是顯示啟動子載體pDZ-lysCP1遺傳圖譜的示意圖。

最佳實施方式

根據(jù)其一方面，本發(fā)明涉及具有SEQ?ID?NO.2核苷酸序列的谷氨酸棒桿菌來源的核酸分子，其可操作地連接到編碼天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脫氫酶的操縱子，并顯示改進的啟動子活性。

術(shù)語“啟動子”如本文所用，指含有RNA聚合酶初始結(jié)合位點并促進其下游特定基因轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。即，啟動子是非翻譯核苷酸序列，編碼區(qū)域的上游，RNA聚合酶結(jié)合于此從而起始基因轉(zhuǎn)錄，并通常位于其調(diào)節(jié)的基因附近，在同一條鏈上游(接近正義鏈的5’區(qū)域)。