[發明專利]橋梁分子1的小RNA干擾片段

無效

• 申請號: 200910307311.1
• 申請日: 2009-09-18
• 公開（公告）號: CN101691571A
• 公開（公告）日: 2010-04-07
• 發明（設計）人: 谷峰;馬勇杰;王冰冰;牛瑞芳;付麗
• 申請（專利權）人: 天津醫科大學附屬腫瘤醫院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;A61P35/00
• 代理公司: 天津市宗欣專利商標代理有限公司 12103
• 代理人: 董光仁

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體是用于抑制惡性膠質瘤細胞的增殖和促進膠質瘤細胞凋亡的橋梁分子1的小RNA干擾片段。

背景技術

RNA干擾是由雙鏈RNA所引起的序列特異性基因沉默，是真核生物中一種非常保守的機制，它與協同抑制、轉錄子沉默以及發育等許多重要的生物學過程密切相關。

RNA干擾依賴于小干擾RNA(Small?interference?RNA，siRNA)與靶序列之間嚴格的堿基配對，具有很強的特異性，涉及眾多基因和蛋白復合物，構成了一個以小RNA為核心的真核基因表達調控系統，它可以在染色質水平、轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平參與基因表達的調節。RNA干擾技術為人們迅速、準確的剖析基因的功能，分析基因之間錯綜復雜的聯系和相互作用提供了極為有用的工具，同時也為人們預防和治療癌癥和病毒疾病提供了新的思路，例如：研究信號傳導通路和基因功能RNAi能夠在哺乳動物中降低特異性基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時間，控制基因表達的部位，以開展基因治療的新途徑。

惡性膠質瘤是一類惡性程度極高的惡性腫瘤，占顱內原發腫瘤的40％和中樞神經系統惡性腫瘤78％。惡性膠質瘤向周圍正常腦組織侵襲浸潤是其致死的主要原因，盡管現代的診斷和治療技術已經有了長足的發展，其中位生存時間仍然不超過15個月。迄今為止惡性膠質瘤侵襲浸潤的分子機制，尚未完全明確。

橋梁分子1(Intersectinl)是一種在進化上高度保守的具有多個功能域的蛋白，基因位于人類的第21條染色體，橋梁分子1借助自身的各種功能域可以與多種蛋白結合從而發生相互作用的特性。目前的研究表明橋梁分子1既能夠參與胞吞胞吐作用又參與細胞內信號傳導通路的調節。

發明內容

本發明是為了解決惡性膠質瘤病人腫瘤惡性增殖的問題，提供一種橋梁分子1的小RNA干擾序列。

本發明是按以下技術方案實現的。

一段橋梁分子1的小RNA干擾片段，該片段降低橋梁分子1蛋白的表達，并對橋梁分子1參與的細胞增殖和凋亡產生抑制作用，該片段的RNA序列為：

5’-UUUCAGUACAACUAUGUCCUU-3’。

所述橋梁分子1的小RNA干擾片段，轉染入人膠質瘤細胞系后，特異的降解與其互補的橋梁分子1的信使RNA，具有抑制惡性膠質瘤LN-229細胞的增殖和促進凋亡的作用。

鑒于在細胞內信號傳導方面，橋梁分子1能夠調控惡性膠質瘤細胞的增殖和凋亡，因此通過小RNA干擾片斷進行基因敲除可以靶向抑制橋梁分子1的表達，并對橋梁分子1參與的細胞增殖和凋亡功能產生抑制作用。將其制成藥物，為腫瘤的基因治療提供一種可行的技術手段，用于治療腫瘤病人。

附圖說明

圖1是人惡性膠質瘤細胞轉染橋梁分子1后的橋梁分子1蛋白表達水平；

圖2是體外細胞增殖轉染小RNA組的細胞增殖能力；

圖3是細胞MTT分析實驗結果；

圖4A是用Annexin?V-FITC凋亡檢測試劑盒對照組檢測結果；

圖4B是用Annexin?V-FITC凋亡檢測試劑盒干擾組檢測結果；

圖5是流式細胞儀檢測細胞色素C的釋放情況。

具體實施方式

一.實驗材料來源

人惡性膠質瘤細胞LN-229細胞株由美國德克薩斯大學MD?Anderson癌癥中心提供，所使用的流式細胞儀為天津市腫瘤醫院購置的EPICS?XL型儀器(Coulter?Inco.USA)，橋梁分子1抗體來自于Abcam公司，MTT購自Sigma公司，Annexin?V-FITC凋亡檢測試劑盒購自Biovision公司，細胞色素C抗體購自Biolegend公司，細胞培養耗材購自corning公司。

二.橋梁分子1小RNA干擾序列的設計與合成

依據Ambion公司在網上提供的小RNA設計軟件設計特異的小RNA干擾片段，并由上海英俊生物公司合成。

小RNA干擾片段序列為5’-UUUCAGUACAACUAUGUCCUU-3’。

三.橋梁分子1小RNA干擾序列轉染惡性膠質瘤細胞

轉染前一天，先將10⁵膠質瘤細胞LN-229接種于細胞培養板中，每孔中加入500微升無抗生素的培養液，使轉染時的細胞密度能夠達到30％-80％。轉染時采用脂質體2000(Invitrogen)進行稀釋，然后與2微升的小RNA混合并加入到細胞中，24小時后進行各種細胞功能學實驗。

四.檢測轉然后的細胞中橋梁分子1的表達水平