[發明專利]微生物同步發酵正十六烷生產十六碳二元酸的方法

在審

• 申請號: 200910256589.0
• 申請日: 2009-12-30
• 公開（公告）號: CN102115768A
• 公開（公告）日: 2011-07-06
• 發明（設計）人: 曹務波;陳遠童;曹荀梅子
• 申請（專利權）人: 曹務波
• 主分類號: C12P7/44
• 分類號: C12P7/44;C12R1/74
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 辛向東

技術領域：

本發明是利用微生物發酵正烷烴生產長鏈α，ω-二羧酸的方法，特別是高產十六碳二羧酸的方法。

背景技術：

長鏈二羧酸是一類重要的化工原料，可用來制造高性能尼龍工程塑料，高檔熱熔膠，長效降糖藥，樹脂，涂料以及香料等。特別是十六碳二羧酸，是制造環十五酮的重要原料，前者具有純麝香香味，是一種高級麝香香料；后者可以代替人工合成胰島素，治療糖尿病。

從上世紀七十年代起，各國利用微生物氧化正烷烴生產長鏈二元羧酸的研究取得突破性進展，1972年日本的內尾良鋪等人在《農業·生物化學》雜志(Agr.biol.chem.Vol.36)“微生物利用正烷烴產生長鏈二羧酸”的文章中，報道了他們用一株陰溝假絲酵母MR-12菌株在1立升發酵罐中，用醋酸鈉作生長碳源，加入15％(v/v)的正十六烷發酵72小時，得到63.3克/升的十六碳二羧酸，正十六烷的轉化率為54％。1978年內尾又在《石油和微生物》雜志報道了擴大試驗的結果，在300立升罐里，醋酸作為生長碳源，正十六烷作為發酵碳源發酵68小時，得到54克/升的十六碳二羧酸，正十六烷轉化率70％。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種新的微生物菌種，以及利用該微生物菌種同步發酵正烷烴生產C₁₀-C₁₈長鏈α，ω-二元酸的方法，尤其是同步發酵正十六烷烴，高產α，ω-十六碳二元酸的方法。

本發明所用的微生物菌株為熱帶假絲酵母(Candida?tropicalis)ly-6，是以一株氧化正烷烴生產混合二羧酸的熱帶假絲酵母(參見《微生物學報》20(1)：88-93，1980)為出發菌株，經過硝基胍和N⁺注入誘變，選育出來生產DC₁₆的優良菌株。

將出發菌株經過一次硝基胍和2次N⁺注入方法處理兩變的微生物菌種液，用生理鹽水分別稀釋為10^-2-10^-4，吸取0.1ml稀釋好的菌液，涂布于10波林糖度的麥芽汁瓊脂培養平板上，每個稀釋度涂布5個平板，用黑紙包好，置于30℃的培養箱中培養46小時，統計致死率。

菌種篩選：以出發菌株為對照，對誘變后的菌株進行發酵產酸試驗及產酸量檢測，篩選培育出來的一株ω-氧化能力更強，同化正烷烴能力和β-氧化能力更弱，并能高產α，ω-十六碳二羧酸的菌株，即為熱帶假絲酵母(Candida?tropicalis)ly-6，該菌種能以C₁₀-C₁₈的各種單一正烷烴和混合正烷烴，尤其是正十六烷為基質原料，發酵生產出相應的長鏈二羧酸。

本發明熱帶假絲酵母(Candida?tropicalis)ly-6已于2009年10月14日在中國典型培養物保藏中心進行保藏，地址為中國武漢武漢大學，保藏號為：CCTCC?NO：M?209224。

熱帶假絲酵母(Candida?tropicalis)ly-6的生理特性如下：

糖類的發酵：葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麥芽糖+，乳糖-。

同化：葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麥芽糖+，纖維二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松三糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤蘚醇-，露醇+，肌醇-，核糠醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，檸檬酸鈉-，丁二酸鈉+，乳酸鈣-。生長素的需要：生物素++，維生素B₁++，維生素B₂+，維生素B₆+，維生素B₁₂+，葉酸+，煙酸+，泛酸+，肌醇+，對氨基苯甲酸+。其他：硝酸鹽-，凍化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。

熱帶假絲酵母(Candida?tropicalis)ly-6形態特征：奶油白他，皺褶型，菌落為蛋糕狀和桃酥狀。

培養特征：

在麥芽汁液體培養基中培養時，假菌絲多而長；在烷烴種子培養基中培養時，有一定數量的短假菌絲；而在發酵培養基中發酵時，大部分是單個橢圓細胞。

本發明所述同步發酵生產長鏈二羧酸，特別是十六碳二羧酸的方法是以熱帶假絲酵母(Candida?tropicalis)ly-6為發酵菌種，在以正十六烷為發酵基質的培養基中同步發酵，生產α，ω-十六碳二元酸。

同步發酵生產二元酸過程中所使用的熱帶假絲酵母(Candida?tropicalis)ly-6的種子培養方法如下：