[發明專利]利用內生菌和微生物發酵法制備松脂醇二葡萄糖苷的方法

無效

• 申請號: 200910254491.1
• 申請日: 2009-12-24
• 公開（公告）號: CN102002462A
• 公開（公告）日: 2011-04-06
• 發明（設計）人: 師俊玲
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P19/44;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

該發明涉及松脂醇二葡萄糖苷的制備方法，具體是一種利用內生菌和微生物發酵法制備松脂醇二葡萄糖苷的方法。?

背景技術

杜仲(Eucommia?ulmoides?Oliv.)是中國傳統的名貴中藥，其降血壓功能持續、穩定、無副作用，是其他化學降壓藥無法比擬的。已有研究證明，杜仲中主要降壓成分是松脂醇二葡萄糖苷(PDG)。獲取杜仲中功能性成分的傳統方法是利用杜仲的皮、葉進行提取。這種方法受到材料來源的限制，無法滿足市場需求，而且會破壞杜仲資源，不利于可持續發展。?

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種從杜仲中分離一株內生菌，再經過微生物發酵法制備松脂醇二葡萄糖苷的方法。與傳統方法相比，用微生物發酵法生產植物有效成分具有簡便、快速、成本低等特點。?

從杜仲中分離到的一株內生菌為擬莖點菌屬XP-8(Phomopsis?sp.XP-8)，于2009年12月1日由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏單位地址：中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC?M209291。?

內生菌XP-8的制備方法如下：?

(1)取新鮮的杜仲樹皮，切成約0.5cm×0.5cm大小的小塊，先在70％酒精中浸泡1min，然后用3％次氯酸鈉(有效氯)溶液處理2min，無菌水清洗兩次，接種于PDA培養基平板上，25℃下培養；?

(2)培養3-5d，待平板上菌絲萌發時，用劃線或稀釋等分離方法，挑取形態不同的菌落，轉入到PDA斜面培養基上，在25℃條件下培養。經過分離、篩選、純化的反復過程，直至得到純化的典型菌落；?

(3)純化后的菌種移至PDA培養基的斜面上培養后，4℃保存。?

一種利用內生菌和微生物發酵法制備松脂醇二葡萄糖苷的方法包括以下步驟：?

(1)液體種子的制備：取2cm²活化好的內生菌XP-8菌種接入種子培養基中，裝液量為100ml/250ml三角瓶，在28℃，180r/min條件下搖床培養120h；?

(2)液體發酵：以10％(V/V)的接種量將上述培養好的液體種子接入發酵培養基中，發酵培養基在發酵罐中的裝量為發酵罐體積的40％～70％，控制發酵罐的攪拌轉速為160～180r/min，發酵液溫度控制為28℃，培養168～240h；?

(3)產物的分離：發酵結束后，取發酵液，在5000r/min下離心10min；取上清液，加入2倍于發酵液體積的95％乙醇溶液，靜置24h；然后在5000r/min下離心10min；取上清液，在40℃、真空度0.05～0.09MPa的真空度下減壓濃縮10～20倍，高速離心13000r/min，10min，取上清液；?

(4)產物的提?。哼x用樹脂S-8對(3)中所得上清液進行吸附，吸附時，發酵液中松脂醇二葡萄糖苷的濃度為0.195mg/ml，溫度為20℃，pH值為9，控制流速1BV/h，溶液處理量20BV；然后，再用洗脫液進行洗脫，洗脫條件是：以30％的乙醇水溶液為洗脫液，控制洗脫液流速1BV/h，洗脫液用量為6BV；收集全部洗脫液，在40℃、真空度0.05～0.09MPa的真空度下蒸發出所有乙醇，所得液體即為松脂醇二葡萄糖苷的粗提液，整個純化過程對發酵液中松脂二葡萄糖苷的收集率為89.8％；?

(5)產物的純化：將(4)中所得松脂醇二葡萄糖苷粗提液用孔徑為0.45μm的水性醋酸纖維微孔濾膜過濾，取濾液在制備液相色譜儀上進行純化，收集出峰時間在4.46-4.47min處的組分，即為松脂醇二葡萄糖苷溶液。蒸發揮干溶液中溶劑，所得粉末，即為松脂醇二葡萄糖苷的純品；?

上述制備過程中，所用培養基分別為：?

內生菌XP-8菌種保藏培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)，自然p?H(約7.2)；?

種子培養基：采用察氏培養基，組成為蔗糖30.0g，NaNO₃?2.0g，K₂HPO₄1.0g，KCl?0.5g，MgSO₄·7H₂O?0.5g，FeSO₄·7H₂O(100g/L)2滴，蒸餾水1000mL，自然p?H(約7.89)；?