[發明專利]用于檢測鑒定傷寒沙門氏菌核酸片段的引物、探針及芯片

有效

• 申請號: 200910252872.6
• 申請日: 2009-11-30
• 公開（公告）號: CN102080125A
• 公開（公告）日: 2011-06-01
• 發明（設計）人: 張春秀;黃曉衛;陳金絲;曹歡;邵祥強;肖華勝
• 申請（專利權）人: 上海生物芯片有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 高月紅

1.一種用于檢測鑒定傷寒沙門氏菌核酸片段的引物，其特征在于，其序列包括：SEQ?ID?NO.2所示的上游引物序列和SEQ?ID?NO.3所示的下游引物序列組成的引物對序列。

2.如權利要求1所述的用于檢測鑒定傷寒沙門氏菌核酸片段的引物，其特征在于：所述引物進行聚合酶鏈式反應所產生的產物的片段大小為159bp。

3.如權利要求1所述的用于檢測鑒定傷寒沙門氏菌核酸片段的引物用于傷寒沙門氏菌的聚合酶鏈式反應或基因芯片，特異性地檢測樣本中的傷寒沙門氏菌。

4.一種用于檢測鑒定傷寒沙門氏菌核酸片段的探針，其特征在于：該探針序列由兩部分組成，其組成為5’-Zc-P-3’，其中，5’端的Zc是與基因芯片上固定的探針Z互補的序列，3’端的P是SEQ?ID?NO.4所示的傷寒沙門氏菌基因的特異序列。

5.如權利要求4所述的用于檢測鑒定傷寒沙門氏菌核酸片段的探針，其特征在于：所述Z和Zc是與所檢測的物種沒有同源性的人工合成的長度為20-25pb的一對互補序列。

6.如權利要求4所述的用于檢測鑒定傷寒沙門氏菌核酸片段的探針用于傷寒沙門氏菌的基因芯片，特異性地檢測樣本中的傷寒沙門氏菌。

7.如權利要求4所述的用于檢測鑒定傷寒沙門氏菌的基因芯片，其特征在于：包括：如權利要求4所述的用于檢測鑒定傷寒沙門氏菌核酸片段的探針和固定在固相載體上的Z探針，其中，如權利要求4所述的探針5’端連接有與Z探針互補的Zc序列。

8.如權利要求7所述的用于檢測鑒定傷寒沙門氏菌的基因芯片，其特征在于：所述用于檢測鑒定傷寒沙門氏菌核酸片段的探針能在其DNA末端片段上進行標記，該標記包括：熒光素標記、生物素標記、放射性元素標記、電化學發光標記和酶標記。

9.一種應用權利要求7所述的基因芯片進行檢測的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)使用商業化的DNA抽提試劑盒，按照試劑盒的說明制備樣品DNA模板，通過PCR反應對目的基因進行擴增；

2)取2-10μl?PCR擴增產物，使用1-5U的蝦堿酶SAP和5-15U的外切酶Exo?I進行純化后，加入如權利要求4所述的用于檢測鑒定傷寒沙門氏菌核酸片段的探針0.1-0.4μM和0.1-0.4μM熒光標記的雙脫氧核苷Cy3-ddATP，進行單堿基延伸反應，反應中所加入的DNA聚合酶為0.8-1.5U，在退火溫度66-72℃的條件下循環30-35次，產生帶有熒光標記的產物；

3)對帶有熒光標記的產物，加入終濃度為6×SSPE或6×SSC的雜交液，與已經固定有Z的基因芯片在46-50℃雜交1.5-2.5小時，雜交結束后，分別使用含有2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、無SSC的清洗液清洗，干燥芯片后，使用芯片掃描儀檢測雜交反應的結果。

10.如權利要求9所述的基因芯片進行檢測的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的目的基因包括16S基因、傷寒沙門氏菌的H1d基因，其PCR反應體系為：PCR緩沖液0.7-1.2×，dNTP?0.1-0.2mM，上下游引物各0.1-0.4μM，該上下游引物包括用于檢測鑒定傷寒沙門氏菌核酸片段的上下游引物及16S基因的上下游引物，酶0.2-0.6×，DNA模板20pg-20ng，PCR反應總體積為10-20ul；PCR反應條件為：95℃變性3min；之后在95℃變性30s，58-65℃退火30s，68℃延伸30s的條件下，循環28-35次；68℃延伸5min。