[發明專利]一種從體液代謝組輪廓篩選糖尿病標記物的方法

有效

• 申請號: 200910248531.1
• 申請日: 2009-12-18
• 公開（公告）號: CN102103132A
• 公開（公告）日: 2011-06-22
• 發明（設計）人: 許國旺;李響;路鑫
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/86;G06F19/00
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳;周秀梅

1.一種從體液代謝組輪廓篩選糖尿病標記物的方法，其特征在于：采用氣相色譜質譜聯用儀對體液代謝物進行分析得到代謝組輪廓，建立雙重交叉驗證篩選模型分析糖尿病人和健康人的代謝組輪廓，篩選糖尿病特異性標記物。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，采用氣相色譜質譜聯用儀對體液代謝物進行分析得到代謝組輪廓，包括如下步驟：

1)體液樣本的收集和預處理：

取于≤-60℃下保存的N1個糖尿病人和N2個健康人的體液樣本，N1≥10的正整數，N2≥10的正整數；

代謝組輪廓分析前，將體液樣本在室溫條件下解凍；解凍后震蕩混勻，分別在100μL體液中加入300μL甲醇，震蕩混勻，離心后取上層清液；上層清液經冷凍干燥后，使用bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide進行三甲基硅烷化衍生處理；

2)氣相色譜質譜聯用儀分析血漿中的代謝物：

色譜質譜聯用分析，

使用30m×250μm×0.25μmHP-5毛細管氣相色譜柱，載氣為高純氦，程序升溫為：70℃恒溫3min，以10℃min^-1升溫至320℃，恒溫5min，進樣口溫度280℃，進樣2μL，分流比5∶1；

質譜部分傳輸線溫度270℃，，質譜掃描范圍m/z?33-500，采集頻率2Hz。離子源溫度220℃，EI源電離電壓70eV；

LECO公司的ChromaTOF^TM軟件version?3.25采集原始代謝組輪廓數據；

3)建立雙重交叉驗證篩選模型分析糖尿病人和健康人的代謝組輪廓，

A.采集的原始代謝組輪廓數據由LECO公司的ChromaTOF^TM軟件version?3.25分析得到含有代謝物濃度信息的代謝物峰表，峰表中各代謝物的結構和名稱由ChromaTOF^TM軟件自帶的NIST譜圖庫定性，各個樣本的峰表經過EXCEL軟件合并之后即可得到代謝組輪廓數據；

B.將糖尿病人和健康人的代謝組輪廓數據作為雙重交叉驗證篩選模型的輸入矩陣；根據Matlab軟件的randperm程序，數據矩陣被分為模型集和測試集，使用模型集的數據進行偏最小二乘判別分析PLSDA，在內層交叉驗證過程中得到初步的代謝物篩選模型；

C.將測試集的數據輸入初步的代謝物篩選模型，通過測試結果進行偏最小二乘判別分析，估計模型的誤差并進行參數的優化，主要是針對模型的主成分數N_pc，在外層交叉驗證過程中得到最終的代謝物篩選模型；

D.通過“置換檢驗”permutation?test驗證最終的代謝物篩選模型；

4)使用雙重交叉驗證篩選模型篩選糖尿病特異性標記物：

計算得到的最終的代謝物篩選模型中，各個代謝物在不同主成分中的權重值w；權重值w代表在偏最小二乘分析模型中，各個代謝物對于模型的建立和分類信息的解釋、預測的重要程度；統計在兩個或三個主成分中w的絕對值均大于閾值k的代謝物，當只有一個主成分時，則統計在該主成分中w的絕對值大于k的代謝物，這些代謝物被選為候選標記物；其中閾值k的選擇根據權重值的大小確定，使得不多于20個代謝物被選擇作為候選標記物；

計算候選標記物在所有參與建模的糖尿病人和健康人中的平均值和標準偏差，只保留在糖尿病人和健康人中平均值均大于標準偏差的候選標記物，再使用EXCEL軟件的TTEST函數對候選標記物在所有參與建模的糖尿病人和健康人間做T檢驗，得到T檢驗的p值，若p值小于0.05，則該候選標記物被確認為體液代謝組輪廓篩選出的糖尿病標記物。