[發(fā)明專利]一種單分散性磁性人鐵蛋白的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910244505.1
• 申請日: 2009-12-30
• 公開（公告）號: CN102115746A
• 公開（公告）日: 2011-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹長乾;田蘭香;潘永信
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院地質(zhì)與地球物理研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/74;C07K14/47
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 周長興

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于磁性納米材料的仿生合成技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種單分散性的磁性人鐵蛋白的制備方法。

背景技術(shù)

超順磁磁鐵礦(Fe₃O₄)或者磁赤鐵礦(γ-Fe₂O₃)由于其優(yōu)良的磁性能以及納米尺寸效應(yīng)，被廣泛地應(yīng)用于電子學(高密度磁存儲)、化工(磁流體、催化、涂料)、環(huán)境學(環(huán)境修復(fù))和生物醫(yī)學(磁靶向藥物、磁共振造影增強劑、細胞標記分離、DNA分離、疾病診斷)等領(lǐng)域。但是在納米磁性顆粒的制備領(lǐng)域中，如何合成粒徑均一、形狀相同、分散性好和單分散性的納米磁性顆粒一直是研究的熱點。

鐵蛋白是天然的鐵礦化蛋白，它廣泛分布于微生物、植物、動物以及人體內(nèi)，在機體內(nèi)發(fā)揮著解除二價鐵離子的毒性以及貯鐵的功能，在機體內(nèi)的鐵代謝以及鐵的生物礦化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。天然鐵蛋白由于蛋白亞基的高度自組裝，能夠形成球形的籠狀蛋白殼結(jié)構(gòu)，其外直徑約為12nm，內(nèi)直徑約為8nm，尺寸高度均一。每個籠型的蛋白殼內(nèi)部含有一鐵核，天然鐵蛋白的鐵核約為6-8nm，其成分是反鐵磁性的水合氧化鐵。天然鐵蛋白的鐵核在酸性條件以及還原劑存在的條件下進行釋放從而形成空殼鐵蛋白，而且由于空殼鐵蛋白仍然保持其均一的籠型結(jié)構(gòu)，所以能夠作為納米材料仿生合成的模板，合成的納米材料通常具有尺寸均一、形狀相似、分散性好和具有天然的蛋白殼等優(yōu)點。

磁性鐵蛋白是一種仿生合成材料，是一種具有磁鐵礦或者磁赤鐵礦內(nèi)核的鐵蛋白。傳統(tǒng)的磁性鐵蛋白的合成通常是以天然鐵蛋白為原料，首先在酸性條件和還原劑存在的條件下將原來的水合氧化鐵鐵核去除，形成空殼鐵蛋白，然后再通過化學條件的改變在蛋白殼內(nèi)部形成磁鐵礦或者磁赤鐵礦顆粒(U.S.patent?5491219)。但是這種傳統(tǒng)合成磁性鐵蛋白的路線通常需要去除鐵核形成空殼鐵蛋白這一步驟，這種步驟因為在酸性條件下完成，容易造成蛋白殼的損傷；另外由于這個過程的繁瑣，蛋白的損失量也會增大。而且前人的研究也同樣表明，這種傳統(tǒng)方法合成的磁性鐵蛋白容易聚集，存在磁相互作用(Moskowitz?et?al.，1997)。這種聚集不僅可以影響磁性顆粒的磁學性質(zhì)，而且還會影響其在生物醫(yī)學中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種單分散性磁性人鐵蛋白的制備方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的單分散性磁性人鐵蛋白的制備方法，以重組人鐵蛋白為模板，通過仿生合成，在重組人鐵蛋白的內(nèi)部形成磁性納米顆粒，經(jīng)過分離純化得到單分散性磁性人鐵蛋白，主要步驟如下：

1)以重組人鐵蛋白為模板，將人鐵蛋白的H亞基和L亞基的全長cDNA分別克隆和構(gòu)建到質(zhì)粒上；

2)將含有人鐵蛋白H亞基和L亞基的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化或者共轉(zhuǎn)化細菌Rosetta(DE3)pLysS，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)激活T7啟動子，誘導表達；

3)表達結(jié)束后進行超聲破碎釋放蛋白；

4)對蛋白進行分離和純化；

5)將亞鐵鹽和氧化劑加入重組人鐵蛋白的溶液中進行反應(yīng)，控制pH值為7～11，控制溫度為25～80℃，在重組人鐵蛋白內(nèi)部形成強磁性的納米顆粒；亞鐵鹽的濃度為每次加入的亞鐵原子數(shù)與蛋白分子數(shù)之比在10～200之間，最終每個蛋白分子加入的鐵原子數(shù)可在100～5000之間；氧化劑的濃度為每次加入H₂O₂的分子數(shù)與加入亞鐵離子的原子數(shù)之比為2∶1或3∶1；蛋白濃度＞0.25mg/ml；

6)排阻層析進行分離，離心和分子篩純化后得到單分散磁性人鐵蛋白顆粒。

本發(fā)明的制備方法中，重組人鐵蛋白包括重組人鐵蛋白的H鏈、重組人鐵蛋白的L鏈、重組人鐵蛋白的H鏈和L鏈的組裝體、重組人鐵蛋白的H鏈的突變體或融合蛋白和重組人鐵蛋白的L鏈的突變體或融合蛋白。

本發(fā)明的制備方法中，步驟1之后，對編碼序列進行測序保證具有正確的DNA序列。

本發(fā)明的制備方法中，步驟2中，是當細菌繁殖到OD值為0.7時，再加入IPTG激活T7啟動子，在37℃誘導表達。

本發(fā)明的制備方法其中，步驟3中，是細菌重懸在Tris-HCl緩沖溶液中進行超聲破碎釋放蛋白。

本發(fā)明的制備方法和，步驟4中，采用層析方法、硫酸銨沉淀、離子交換或分子排阻層析分離蛋白。

本發(fā)明的制備方法中，步驟5中，亞鐵鹽和氧化劑為水溶性亞鐵鹽：硫酸亞鐵、硫酸亞鐵銨或氯化亞鐵；氧化劑為雙氧水。