[發明專利]一種金鐵鎖毛狀根系的誘導與培養方法

無效

• 申請號: 200910237579.2
• 申請日: 2009-11-18
• 公開（公告）號: CN102057868A
• 公開（公告）日: 2011-05-18
• 發明（設計）人: 張宗申;劉同祥;韋瑋;崔箭;張繼永;王偉
• 申請（專利權）人: 劉同祥
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12Q1/68
• 代理公司: 北京太兆天元知識產權代理有限責任公司 11108
• 代理人: 張韜

1.一種金鐵鎖毛狀根系高效誘導與培養方法，其特征在于該方法為：

取金鐵鎖幼嫩莖為外植體進行脫分化處理，獲得新鮮金鐵鎖愈傷組織，將愈傷組織與含有Ri質粒的發根農桿菌共培養，以無菌紙吸取多余菌液后轉入到誘導培養基中誘導培養，在金鐵鎖愈傷組織處生長出金鐵鎖毛狀根；抑菌培養后將具有毛狀根的外植體放入擴增培養基中進行毛狀根的擴大培養。

2.如權利要求1所述的金鐵鎖毛狀根系高效誘導與培養方法，其特征在于該方法中所述金鐵鎖幼嫩莖脫分化處理時，是取1～2cm金鐵鎖幼嫩莖段置于MS+2，4-D_0.5mg/L+NAA_0.3mg/L培養基中，25℃±1下暗培養20d；獲得新鮮金鐵鎖愈傷組織。

3.如權利要求1所述的金鐵鎖毛狀根系高效誘導與培養方法，其特征在于該方法中所述發根農桿菌與金鐵鎖愈傷組織共培養，是先在固體YEB培養基中25℃±1下培養2～3d；然后選取單克隆到液體YEB培養基中振蕩培養，菌液離心收集菌體；將菌體置于MS液體培養基中混勻。

4.如權利要求1所述的金鐵鎖毛狀根系高效誘導與培養方法，其特征在于該方法中所述共培養培養基為100umol/L乙酰丁香酮的MS固體培養基，共培養時間為1d；所述誘導培養基為含有500mg/L頭孢噻肟鈉的MS固體培養基。

5.如權利要求1所述的金鐵鎖毛狀根系高效誘導與培養方法，其特征在于該方法中所述介導轉化的外植體放入抑菌培養基中于25℃±1暗黑培養，每3～6d繼代培養一次，至少五次的抑菌培養處理，直至將菌除凈。

6.如權利要求1所述的金鐵鎖毛狀根系高效誘導與培養方法，其特征在于該方法中所述將抑菌處理后具有毛狀根的外植體放入毛狀根擴增培養是在25℃±1暗黑振蕩培養；所述擴增培養基為無激素1/2MS液體基本培養基，所述振蕩培養箱搖床轉速為110～120r·min^-1。

7.一種金鐵鎖毛狀根系高效誘導與培養方法，其特征在于該方法為：

(1)將金鐵鎖幼嫩莖剪成1～5cm的小段，無菌操作臺中用升汞處理6～13分鐘，酒精浸泡5～10秒，無菌水沖洗3～8遍后轉入到MS+2，4-D0.5mg/L+NAA0.3mg/L培養基中，25℃±3下暗培養10～35d，獲得金鐵鎖愈傷組織；

(2)將發根農桿菌ACCC10060菌株用1μL無菌水稀釋后的菌液涂布在20mL?YEB固體培養基上，25℃±3下暗培養1～6d長出克隆菌體；

(3)挑取1菌環單菌落接種于50mL液體YEB培養基中，25℃±3振蕩培養，培養12小時，OD值為0.3～1.2.取1ml菌液置于100mlYEB液體培養基中振蕩培養，培養8小時，OD值為0.3～0.9.收集菌液，3500rpm下離心5～15分鐘收集菌體；

(4)將(3)收集的菌體置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9％瓊脂的MS固體培養基中并混勻；

(5)用(4)混勻后得到的菌液浸染金鐵鎖愈傷組織10～30分鐘，取出后用無菌紙吸取多余的菌液，將浸染的金鐵鎖愈傷組織接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9％瓊脂的MS固體培養基中1～3天；

(6)把含有500mg/L頭孢噻肟鈉的無激素MS固體培養基作為誘導培養基，將(5)浸染后的愈傷組織接入該誘導培養基中，進行抑菌繼代培養；每2～9d繼代培養一次，至少五次的抑菌培養處理，直至將菌除凈；

(7)用無激素1/2MS液體培養基作為擴增培養基，將抑菌處理后1g的誘導出來的毛狀根放入30mL的擴增培養基中，暗黑懸浮振蕩培養，振蕩搖床轉速為110～120r·min-1。