[發明專利]高通量篩選結核分枝桿菌α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉移酶抑制劑的方法

無效

• 申請號: 200910220160.6
• 申請日: 2009-11-26
• 公開（公告）號: CN101845480A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 馬郁芳;辛毅;沙珊珊;董旭
• 申請（專利權）人: 大連醫科大學
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;C12N15/70;G01N21/31;C12R1/19;C12R1/32
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

技術領域：

本發明涉及篩選抗結核藥物的方法，尤其是一種高通量篩選結核分枝桿菌α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉移酶抑制劑的方法。

背景技術：

結核分枝桿菌(Mycobacterium?tuberculosis)是引起結核病(tuberculosis)的病原菌，據WHO報道，目前全球有近1/3的人已感染結核分枝桿菌，每年新發結核病人約9000萬。由于多耐藥(multi?drug?resistant，MDR)菌株及廣泛耐藥(extensive?drug?resistant，XDR)菌株的出現，現有抗結核藥物都無法有效地治愈結核病，導致每年約有200萬人死亡，結核病已成為全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之一。

目前，新藥研制已由過去大多數隨機、偶然和被動的藥物發現過程變為主動的以明確靶標為依據的新藥開發過程，以細菌代謝途徑中的酶或蛋白質作為靶標來篩選先導化合物，是目前研發新的抗生素的一種策略。研究表明，分枝桿菌與革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌相比，具有特殊的細胞壁結構，其核心結構由分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖及肽聚糖三種大分子所構成。分枝菌酸由含70-90碳原子的脂類分子組成，形成致密的低通透性外層，肽聚糖位于細胞壁的最內層并與細胞質膜相連。分枝菌酸與中層的聚阿拉伯糖(由呋喃型阿拉伯糖殘基聚合而成)及聚半乳糖(由呋喃型半乳糖殘基聚合而成)連接后再通過銜接二糖(L-鼠李糖-N-乙酰葡糖胺L-Rhamnose-N-GlcNAc)共價連接到肽聚糖大分子上。因此，銜接二糖是維持分枝桿菌細胞壁完整性的重要結構。

dTDP-鼠李糖是鼠李糖的糖基供體，α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉移酶(RmlA)、dTDP-D-葡萄糖-4，6-脫氫酶(RmlB)、dTDP-4-酮基-6-脫氧-D-葡萄糖3，5表異構酶(RmlC)和dTDP-4-酮基-鼠李糖還原酶(RmlD)催化dTDP-鼠李糖的生物合成，其中RmlA催化第一步反應，使起始底物葡萄糖-1-磷酸和dTTP轉變為dTDP-葡萄糖，其它三步反應由RmlB，RmlC和RmlD三種酶依次催化，最終形成dTDP-鼠李糖，鼠李糖基轉移酶(WbbL)將鼠李糖基轉移到N-乙酰葡糖胺上，形成二糖銜接分子。我們分別構建了rmlA、rmlB、rmlC和rmlD基因敲除菌株，通過測定其在允許溫度和非允許溫度條件下的生長曲線，確定rmlA、rmlB、rmlC和rmlD基因均為分枝桿菌生長必需基因^[1，2，3]，上述四種酶均可作為研發抗結核新藥的靶標，繼而篩選出抑制這四種酶的抑制劑，則抑制劑將成為高度專一而又無任何毒副作用的抗結核新藥。

中國發明專利申請號為03111037.1、名稱為“一種以結核桿菌細胞壁為靶點的藥物篩選方法”的專利申請公開了dTDP-D-葡萄糖-4，6-脫氫酶(RmlB)抑制劑的篩選方法，具體步驟是從結核分枝桿菌基因組文庫中調出rmlB基因，設計引物，PCR擴增rmlB，擴增產物連接到pMD18-T載體上，重組質粒轉化NovaBlue并篩選鑒定，純化rmlB基因片段，測序，將rmlB與pET16b連接，連接產物rmlB-pET16b轉化DH5α并鑒定，陽性質粒轉化大腸桿菌BL21；將含有rmlB基因的大腸桿菌在25～37℃，用0.1～5mM?IPTG誘導表達2～6小時，超聲破碎細胞，離心，取上清夜，利用表達載體上的組氨酸標記，采用組氨酸-Ni+親和層析技術純化得到RmlB酶蛋白；在含有50～100mM?HEPES(pH7.6)、1～10mM?NAD+、100～500nmol?dTDP-Glc、4～12ug/ml蛋白的RmlB酶蛋白溶液中加入中藥、藏藥、天然產物的有效成分或組合化學產物，在25～37℃下培育1～5hr后，再加入1ml?0.1mM?NaOH培育10～40min，取出后以石英比色杯空白(空氣)為對照，紫外分光光度計檢測318nm下吸光度值的變化，根據體系吸光值的變化，確定所加入物質是否是以結核分枝桿菌細胞壁為靶點的藥物。

但以RmlB酶蛋白為靶點的檢測方法存在如下缺點：底物dTDP-葡萄糖(dTDP-Glc)價格昂貴且在溶液中不穩定，因此篩選成本較高；酶促反應時間較長，所以費時費力；由于沒有商業化的反應產物dTDP-4-酮基-6-脫氧葡萄糖標準品，只能在反應體系中添加NaOH使反應產物進一步轉化為不穩定的衍生物，在318nm處測定其吸光度值，因此檢測結果不夠準確且重復性低；酶促反應體系較大，不能在96孔板中完成，所以不能進行高通量篩選。

發明內容：