[發明專利]利用干燥劑提高生物大分子結晶條件篩選成功率的方法

有效

• 申請號: 200910219491.8
• 申請日: 2009-12-15
• 公開（公告）號: CN101717759A
• 公開（公告）日: 2010-06-02
• 發明（設計）人: 尹大川;鹿芹芹;解思曉;陳瑞卿;朱麗;張仙芳
• 申請（專利權）人: 西北工業大學
• 主分類號: C12N9/36
• 分類號: C12N9/36;C12N9/08;C12N9/22;C07K14/62
• 代理公司: 西北工業大學專利中心 61204
• 代理人: 黃毅新

技術領域

本發明涉及一種提高生物大分子結晶條件篩選成功率的方法，特別是利用干燥劑提高生物大分子結晶條件篩選成功率的方法。?

背景技術

正在進行的結構基因組計劃的數據顯示，從基因克隆到解析出結構，成功率很低。其中限制成功率的關鍵問題之一是難以獲得生物大分子的結晶條件。?

為了獲得生物大分子結晶條件，通常的做法是使用大量篩選試劑(即結晶劑)分別與生物大分子溶液混合，以試錯方式尋找其中可以促使生物大分子結晶的溶液條件。文獻“Sparsematrix?sampling：a?screening?method?for?crystallization?of?proteins.1991，Vol.24：409-411”發展了至今廣泛使用的以氣相擴散法為主要手段的Sparse?Matrix?Sampling技術。該研究選擇Hampton?Research公司貨號為HR2-110的Crystal?Screen結晶試劑盒構建結晶溶液體系，統計了數種蛋白質在50種結晶劑緩沖液中的結晶成功率。篩選成功率為所用結晶條件中成功獲得晶體的條件所占的比例。其中溶菌酶結晶成功率為10％，過氧化氫酶結晶成功率為10％，核糖核酸酶A結晶成功率為8％，胰島素結晶成功率為4％。?

氣相擴散法是最常用的生物大分子結晶條件篩選手段，常用的具體方法是懸滴法和坐滴法。氣相擴散法使用一個密封的氣相擴散體系，該體系包含體積大、結晶劑濃度高的池液(不含生物大分子)，及體積小、結晶劑濃度低，但溶有生物大分子的液滴(稱為液滴，下同)。由于液滴中結晶劑濃度低，其溶劑將向結晶劑濃度高的池液擴散，使液滴中生物大分子和結晶劑的濃度不斷增加，直到液滴與池液的蒸汽壓相等，達到平衡為止。在此過程中，液滴中生物大分子和結晶劑濃度增加到合適水平時，發生形核，從而實現結晶。?

氣相擴散法使用一定結晶劑濃度的池液，用以平衡液滴。如果該池液不能將液滴濃縮至生物大分子形核的過飽和度，則即使所使用的篩選試劑能在更高濃度下實現結晶，但在實際篩選時，由于濃度不能達到形核的過飽和度水平，因此得不到晶體。如此將導致結晶條件篩選時遺漏該條件，使最終的結晶成功率下降。?

發明內容

為了克服現有技術生物大分子結晶條件篩選技術結晶成功率低的問題，本發明提供一種提高生物大分子結晶條件篩選成功率的方法。該方法利用干燥劑的強吸濕作用，在氣相擴散法中，使用干燥劑代替池液，起到高度濃縮液滴的作用，使液滴的濃度范圍大幅擴展，以此提高生物大分子結晶篩選的成功率。?

本發明解決其技術問題所采用的技術方案為：一種提高生物大分子結晶條件篩選成功率的方法，其特點是包括下述步驟：?

(a)用HEPES-Na緩沖液或者氨水溶解生物大分子，使生物大分子的終濃度達到2～40mg/ml；?

(b)用Crystal?Screen試劑盒的50種結晶緩沖液對生物大分子溶液混合構建生物大分子結晶篩選溶液體系結晶條件進行篩選；?

(c)使用坐滴板，在每深孔中加入干燥劑，使用自動移液系統將1μl篩選結晶劑和1μl生物大分子溶液混合為結晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封結晶板；?

(d)將結晶板放入控溫箱，恒溫20℃，放置4天后，在顯微鏡下觀察，統計出獲得生物大分子的條件數目；?

所述生物大分子是溶菌酶、過氧化氫酶、核糖核酸酶A或胰島素。?

本發明的有益效果是：在氣相擴散法中采用干燥劑代替池液進行濃縮結晶液滴的方式，可使蛋白質結晶條件篩選成功率由傳統方法的4～10％提高至20～50％。同時，由于不再使用池液，以池液體積150微升計算，篩選試劑消耗成本大幅下降至原成本的百分之一以下。?

下面結合實施例對本發明作詳細說明。?

具體實施方式

實施例1：溶菌酶結晶條件的篩選。?

第一步：將經過六次重結晶的日本Seikagaku公司的貨號為100940的溶菌酶，溶于pH為7.00，0.025mol/L?HEPES-Na緩沖液中，使其終濃度為10mg/ml，用0.22μm的濾膜濾去雜質。?

第二步：本實施例用Hampton公司貨號為HR2-110的Crystal?Screen試劑盒的50種結晶緩沖液對溶菌酶結晶條件進行篩選。?