[發明專利]基于珠母貝外套膜分泌物的珍珠質基質蛋白及其制備方法

無效

• 申請號: 200910219086.6
• 申請日: 2009-11-20
• 公開（公告）號: CN101704887A
• 公開（公告）日: 2010-05-12
• 發明（設計）人: 張榮慶;謝莉萍;劉曉軍;周玉娟;李琪
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/14
• 代理公司: 西安智大知識產權代理事務所 61215
• 代理人: 賈玉健

技術領域

本發明屬于醫學組織工程技術領域，涉及利用動物器官的生理功能獲取的活性功能物質及其制備方法，具體涉及一種基于珠母貝外套膜分泌物的珍珠質基質蛋白，本發明還涉及該珍珠質基質蛋白的制備方法。

背景技術

合浦珠母貝(Pinctada?fucata?Martenssi)，又稱馬氏珠母貝，屬于軟體動物門(Mollusca)，瓣鰓綱(Bivalvia)，珍珠貝目(Pterioida)，珍珠貝科(Pteriidae)，珠母貝屬(Pinctada)，主要分布在我國沿海，是目前世界上用于海水珍珠生產的主要貝類。珠母貝的珍珠層的珍珠質由其外套膜分泌，主要由95％以上的文石晶體(碳酸鈣)和不到5％的有機基質組成，該有機基質-珍珠質基質主要由基質蛋白和多糖組成。珍珠質因為其致密的納米結構和極高的強度成為可供移植的骨骼替代材料，研究者發現珍珠質與其他高分子材料相比，具有極高的生物兼容性，幾乎不發生免疫反應。近期國內外的研究表明，珍珠質中具有誘導成骨作用的物質存在于其水溶性基質中，具有廣泛的醫學應用前景。但現有提取珍珠質的方法，主要以貝殼為原料，從貝殼中提取，由于貝殼中珍珠質的含量極低，限制了其大規模制備。同時，傳統的提取方法中必不可少的脫鈣處理損害了珍珠質中基質蛋白的生物活性，降低了其在醫學上的應用價值。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于珠母貝外套膜分泌物的珍珠質基質蛋白，具有誘導成骨的作用，并不發生免疫反應。

本發明的另一目的是提供一種上述珍珠質基質蛋白的制備方法，無需進行脫鈣處理，避免了對珍珠質基質蛋白生物活性的損害，提高其在醫學上的應用價值。

本發明所采用的技術方案是，一種基于珠母貝外套膜分泌物的珍珠質基質蛋白，該珍珠質基質蛋白采用以下步驟制備得到：

步驟1：將珠母貝外套膜的邊緣深色帶與中心部分分離，然后，將外套膜的中心部分從珠母貝的貝體上分離，得到外套膜原料；

步驟2：將步驟1中得到的外套膜原料放入PBS溶液中浸泡，在0℃～4℃的低溫下，浸泡3小時～6小時，將得到的溶液以15000轉每分鐘的轉速進行離心分離，收集離心分離的上清液，得到外套膜分泌液；

步驟3：將步驟2得到的外套膜分泌液進行超濾和透析除鹽濃縮，得到濃縮液；

步驟4：將步驟3得到的濃縮液進行冷凍干燥，制得總的珍珠質基質蛋白，

或，先將步驟3得到的濃縮液進行冷凍干燥，制得總的珍珠質基質蛋白，然后，對該總的珍珠質基質蛋白進行離子交換柱層析，收集280nm下有吸收峰的蛋白組分，采用十二烷基磺酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳分析收集的蛋白組分，再將該蛋白組分進行高效液相分離，并收集280nm下有吸收峰的單一蛋白組分，之后，將該單一蛋白組分進行冷凍干燥，制得單一珍珠質基質蛋白.

所述步驟2中PBS溶液的體積為外套膜原料體積的500倍～1000倍。

所述步驟3中濃縮液的截留分子量為3KD。

所述步驟4中進行離子交換柱層析時采用的填料為Sephadex?G-75葡聚糖凝膠，流動相為Tris-HCl溶液。

所述步驟4中進行液相分離時采用的填料為C18顆粒，流動相為0％～100％之間梯度遞增的乙腈水溶液。

本發明所采用的另一技術方案是，一種權利要求1所述珍珠質基質蛋白的制備方法，該方法具體按以下步驟進行：

步驟1：將珠母貝外套膜的邊緣深色帶與中心部分分離，然后，將外套膜的中心部分從珠母貝的貝體上分離，得到外套膜原料；

步驟2：將步驟1中得到的外套膜原料放入PBS溶液中浸泡，在0℃～4℃的低溫下，浸泡3小時～6小時，將得到的溶液每分鐘15000轉的轉速進行離心分離，收集離心分離的上清液，得到外套膜分泌液；

步驟3：將步驟2得到的外套膜分泌液進行超濾和透析除鹽濃縮，得到濃縮液；

步驟4：將步驟3得到的濃縮液進行冷凍干燥，制得總的珍珠質基質蛋白，

或，先將步驟3得到的濃縮液進行冷凍干燥，制得總的珍珠質基質蛋白，然后，對該總的珍珠質基質蛋白進行離子交換柱層析，收集280nm下有吸收峰的蛋白組分，采用十二烷基磺酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳分析收集的蛋白組分，再將該蛋白組分進行高效液相分離，并收集280nm下有吸收峰的單一蛋白組分，之后，將該單一蛋白組分進行冷凍干燥，制得單一珍珠質基質蛋白。

本發明方法具有如下優點：

1.直接從珠母貝外套膜的分泌液中富集珍珠質基質蛋白，程序簡單，操作方便，生產成本很低。

2.能夠得到大量的珍珠質基質蛋白，適合規模化生產。