[發明專利]一種單增李斯特菌溶血素O的原核表達及純化方法

無效

• 申請號: 200910197413.2
• 申請日: 2009-10-20
• 公開（公告）號: CN101691582A
• 公開（公告）日: 2010-04-07
• 發明（設計）人: 唐雪明;孫曉飛;趙凱;朱宏;吳瀟;譚芙蓉;王金斌;陶世如;蔣玲曦
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02;G01N33/68;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 費開逵

技術領域

本發明涉及一種單增李斯特菌溶血素O的原核表達及純化方法。

背景技術

農產品和食品安全是一全球性問題，食源性疾病是食品安全的主要問題，近年來，國內外食源性疾病事件頻頻發生，而單增李斯特菌在食源性細菌中毒中占主要地位，李斯特菌屬是最重要的人類食源性病原菌，是90年代食品中四大病原菌之一，在美國被列為7種主要的食源性致病菌之一。

單增李斯特氏菌廣泛存在于自然界中，不易被凍融，能耐受較高的滲透壓，在土壤、地表水、污水、廢水、植物、青儲飼料、爛菜中均有該菌存在，所以動物很容易食入該菌，并通過口腔-糞便的途徑進行傳播。據報道，健康人糞便中單增李氏菌的攜帶率為0.6-16％，有70％的人可短期帶菌，4-8％的水產品、5-10％的奶及其產品、30％以上的肉制品及15％以上的家禽均被該菌污染。人主要通過食入軟奶酪、未充分加熱的雞肉、未再次加熱的熱狗、鮮牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西紅柿、法式餡餅、凍豬舌等而感染，約占85-90％的病例是由被污染的食品引起的。該菌可通過眼及破損皮膚、粘膜進入體內而造成感染，孕婦感染后通過胎盤或產道感染胎兒或新生兒，棲居于陰道、子宮頸的該菌也引起感染，性接觸也是本病傳播的可能途徑，且有上升趨勢。

單增李斯特菌是典型的胞內寄生菌，可在巨噬細胞和許多非吞噬細胞(如上皮細胞、內皮細胞和肝細胞)內增殖。其毒力因子包括李斯特菌溶血素(Listeriolysion0，LLO)，ActA蛋白，磷脂酶C，P60蛋白，PrfA蛋白，內化素，表面蛋白P104。其中LLO是最主要的毒力因子，由hly基因編碼的Hly蛋白，與破壞吞噬體，促進菌體進入胞液有關，是細菌得以在胞液內增殖的先決條件，它的缺失將會導致細菌毒力的全部喪失。不產生LLO的單增李斯特菌突變株雖可在非吞噬細胞的胞液中生存一段時間，但卻不能繁殖，并且因無法逃逸吞噬體而不能對其他細胞的感染。除此之外，LLO還參與了同單增李斯特菌致病性有關的其它反應，研究顯示：一單增李斯特菌感染鼠脾臟和骨髓的樹突狀細胞，可導致細胞的凋亡；不產生LLO的單增李斯特菌突變體不能誘導細胞的凋亡，而提純的LLO則可引起這種程序性控可引起這種程序性控制的細胞死亡。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種制備單增李斯特溶血素O的原核表達及純化方法，選取致病性李斯特菌主要毒力因子--溶血素O為對象，利用原核表達系統表達溶血素O蛋白，以親合層析純化表達產物，獲得較高純度的表達蛋白溶血素O。

為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案來實現：

一種單增李斯特菌溶血素O的原核表達方法，包括以下步驟：

1)根據NCBI上登錄的單增李斯特菌的基因序列，以及所要連接的載體PMD18-T的多克隆位點設計引物，進行PCR擴增、電泳和回收，并對該PCR回收物進行DNA連接反應；

2)大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化；

3)堿法小量制備質粒DNA；

4)表達質粒的重組構建、重組菌的誘導表達。

所述引物序列如下：

正向引物Hly-F：5’-GCGTCGAC(SalI)CCAATTGCGCAACAAACTGA-3’

反向引物Hly-R：5’-CCCTCGAG(XhoI)TTTTGCGGAACCACCGTAA-3’。

所述大腸感受態細胞為E.coli?DH5α和E.coilBL21(DE3)。

進一步的，通過Ni-NTA親和層析進行表達蛋白純化。

所述單增李斯特菌溶血素O蛋白的抗體在金標速測卡中的應用。

本發明是通過制備溶血素O的抗體在膠體金免疫技術中的應用來達到檢測單增李斯特菌的目的。膠體金免疫技術，是90年代新興的一種免疫學方法，現在生物醫學各領域得到了日益廣泛的應用。它實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程，顯色程度與抗原含量成正比。

通過制備單增李斯特菌溶血素O蛋白進而獲得抗體制作膠體金免疫層析試紙條，以便在食品檢測中快速，準確的檢測出單增李斯特菌。