技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因?qū)爰夹g(shù)。

背景技術(shù)

基因?qū)胂到y(tǒng)或方法可以分為兩類：病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)，以逆轉(zhuǎn)錄病毒、 腺病毒、腺相關(guān)病毒為載體；非病毒型基因?qū)耄顼@微注射、基因槍、磷酸 鈣共沉淀、陽離子脂質(zhì)體法、以及新興的納米基因?qū)氩牧稀Ｓ捎诓《拘突? 導(dǎo)入系統(tǒng)存在許多嚴(yán)重的不足，如病毒轉(zhuǎn)染有可能激活原癌基因等，故非病毒 型轉(zhuǎn)染方式是目前的研究熱點，在上述非病毒式轉(zhuǎn)染中，顯微注射一次只能處 理一個細(xì)胞；基因槍穿透力十分有限；磷酸鈣共沉淀法結(jié)果不穩(wěn)定；僅陽離子 脂質(zhì)體法表現(xiàn)了良好的轉(zhuǎn)染效率，但是過高的毒性又限制了它的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明提供一種基因?qū)氩牧霞爸苽浞椒ǎ哂辛? 好的細(xì)胞相容性和穩(wěn)定且較高的轉(zhuǎn)染效率。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明基因?qū)氩牧系募夹g(shù)方案為：一種基因?qū)氩? 料，它為碳酸鈣和植酸鈣組成的復(fù)合材料，平均粒徑為200納米左右，其中碳 酸鈣含量為80％，植酸鈣含量為20％。

所述基因?qū)氩牧虾途G色熒光蛋白質(zhì)粒基因pGFP以非共價方式結(jié)合形成基 因?qū)胂到y(tǒng)，用于基因轉(zhuǎn)染。

制備基因?qū)氩牧系姆椒榘ㄈ缦虏襟E：(1)取分析純的氯化鈣、碳酸 銨在乙醇中超聲，然后依次用雙蒸水、洗液、雙蒸水、丙酮清洗，最后在空氣 中晾干；(2)用去離子水溶解氯化鈣制備0.01M新制的氯化鈣溶液；(3)在 80mL0.01M氯化鈣溶液中加入80mg植酸，攪拌混勻后將其分裝在4個燒杯中， 所述每個燒杯中裝有0.25mL植酸，起始濃度為1g/L，起始PH＝3.0；(4)將所 述燒杯用parafilm封口，并在parafilm上對稱地扎三個針眼。放置于干燥器 上層，干燥器下層擺放3個對稱放置的10mL小燒杯，每個小燒杯中裝滿研磨細(xì) 的碳酸銨粉末，小燒杯也以parafilm封口，并在parafilm上對稱地扎三個針 眼；(5)蓋上干燥器蓋進行擴散法反應(yīng)；(6)6小時后取出樣品，在8000r/m速 度離心，之后用雙蒸水洗至PH＝7，再用乙醇洗，然后在室溫下晾干。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的基因?qū)氩牧暇哂幸韵聝?yōu)點：(1)具有較高的 轉(zhuǎn)染效率，在人血管平滑肌細(xì)胞中可以達到40％左右；(2)低毒性，因碳酸鈣、 磷酸鈣都具有良好的生物相容性，細(xì)胞生存率很高；(3)材料分散性良好，符 合對轉(zhuǎn)染的要求；(4)非常低的成本，植酸是食品添加劑，成本很低，另外實 驗中使用的化學(xué)藥品，氯化鈣和氨水都是常見廉價試劑；(5)材料制備反應(yīng)簡 單易操作，可重復(fù)性好。

附圖說明

圖1為本發(fā)明基因?qū)氩牧系膾呙桦婄R圖片；

圖2為基因?qū)氩牧系耐渡潆婄R圖片；

圖3為轉(zhuǎn)染后的倒置熒光顯微鏡下的熒光圖片；

圖4為轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞生存率圖片；

圖5為轉(zhuǎn)染效率圖；

圖6為轉(zhuǎn)染試驗圖。

圖7為綠色瑩光蛋白(GFP)基因表之圖。

具體實施方式

一、本發(fā)明基因?qū)氩牧?ACC，經(jīng)過植酸鈣修飾后功能化的納米無定形碳 酸鈣)的制備：

1、原料準(zhǔn)備

分析純的氯化鈣、碳酸銨、植酸(分子量，MW660)，前述原料均是 Aldrich公司產(chǎn)品。所有的原料制備用玻璃器皿，均在乙醇中超聲5分鐘， 然后雙蒸水清洗，并用洗液H₂O/HNO₃(65％)/H₂O₂(35％)(1∶1∶1，v/v/v) 清洗，之后再用雙蒸水、丙酮依次清洗，最后在空氣中晾干。

2、基因?qū)氩牧现苽浞椒?