[發明專利]副溶血弧菌外膜蛋白VP1061的制備及其免疫保護功能的應用

無效

• 申請號: 200910193560.2
• 申請日: 2009-11-02
• 公開（公告）號: CN101703768A
• 公開（公告）日: 2010-05-12
• 發明（設計）人: 彭宣憲;熊筱鵬;葉明芝;李惠
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: A61K39/106
• 分類號: A61K39/106;A61P31/04
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 華輝

技術領域

本發明涉及副溶血弧菌外膜蛋白VP1061的制備方法及其免疫保護功能的應用。

背景技術

副溶血性弧菌(Vibrio?parahaemolyticus)是海水中常見的弧菌之一，是近年來引發微生物性食物中毒居首位的病原菌，也是水產養殖中的一種重要致病菌。對這類致病菌的防治主要包括藥物即抗生素防治以及免疫防治?？股仉m然在最初的使用中取得了巨大的進展，然而隨著抗生素的廣泛使用，也出現了一系列的相關問題，一方面抗生素的不合理使用，增加抗生素耐藥菌的產生，細菌感染增多；另一方面，因抗生素的耐藥性而人為地加大劑量，加劇耐藥性的產生。因此，研制以具有免疫保護作用的高效中和抗原為成分的疫苗具有廣闊的應用前景。

在各種動物疾病的防治中，疫苗的使用是一個低成本、高效的方法，并且已經有部分疫苗得到大規模使用并取得了不錯的防治效果。疫苗種類很多，以細菌為例，包括全菌疫苗、亞單位疫苗以及DNA疫菌等。從實際應用的情況來看，全菌疫苗雖然具有制作相對簡單而且成本也較低的優點，但也存在不少由于使用全菌體而固有的一些缺點，如減毒全菌疫苗可能出現菌株突變而導致毒性恢復等不良后果；滅活全菌疫苗則往往由于對細菌進行滅活而導致一些免疫保護基團活性改變，影響免疫保護的效果。而且對全菌疫苗來說，由于細菌成分的復雜性，其中往往存在一些毒性成分(如LPS等)，會導致機體產生不良反應。常規制得的全菌疫苗免疫保護效果并不理想，然而，全菌疫苗仍然是目前最為主要的疫苗種類，其原因可能與高效中和抗原的發現和鑒定困難有關。

基因組學、蛋白質組學和轉錄分布圖技術的發展，為細菌疫苗提供了新的契機?；蚬こ桃呙缬捎谄涓咝Ф覕[脫了傳統疫苗的種種缺點，成為疫苗研究的重點，具有廣闊的應用與開發前景。外膜蛋白(outer?membrane?protein，OM?protein)是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分之一，由于外膜蛋白直接面對宿主的體液及組織，細菌利用外膜蛋白進行黏附、侵入和炎癥等生理活動，更容易被宿主識別作為攻擊目標，使得革蘭氏陰性菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，不僅可以刺激體液免疫，而且對細胞免疫亦有刺激作用。近年來，細菌的一些外膜蛋白已經被證實具有良好的免疫原性，對細胞免疫和體液免疫均有刺激作用，用其制備基因工程疫苗具有良好的前景，例如在大腸桿菌中發現外膜蛋白OmpX的免疫保護功能。然而，副溶血弧菌外膜蛋白VP1061的免疫保護功能及其應用尚未被報道。

發明內容

本發明提供了副溶血弧菌外膜蛋白VP1061的制備方法，包括以下步驟：

1)副溶血弧菌外膜蛋白VP1061基因的擴增；

2)副溶血弧菌外膜蛋白VP1061基因的克隆、篩選；

3)副溶血弧菌外膜蛋白VP1061基因的表達；

4)副溶血弧菌外膜蛋白VP1061的純化。

本發明還提供了副溶血弧菌外膜蛋白VP1061作為疫苗組分的應用。其中，所述的疫苗用于抵抗細菌感染，包括抵抗副溶血弧菌、溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌以及嗜水氣單胞菌的感染。

本發明還提供了副溶血弧菌外膜蛋白VP1061在制備抗細菌感染制劑中的應用。其中，所述的細菌包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌。

副溶血弧菌外膜蛋白VP1061的被動免疫保護試驗、主動免疫保護試驗及主動交叉免疫保護試驗結果表明：副溶血弧菌外膜蛋白VP1061免疫鯽魚后可顯著提高鯽魚對致病性副溶血弧菌的抵制力；免疫鯽魚和小鼠后還可以提高鯽魚和小鼠對溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌的抵抗力。由此可見，副溶血弧菌外膜蛋白VP1061具有明顯的免疫保護作用，可用作疫苗組分或者抗細菌感染制劑，用于防治副溶血弧菌、溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌感染所導致的疾病。

附圖說明

圖1為VP1061基因PCR反應產物瓊脂糖凝膠電泳分析圖，其中M為DNA分子量標準；

圖2為VP1192基因PCR反應產物瓊脂糖凝膠電泳分析圖，其中M為DNA分子量標準；

圖3為重組PV1061基因和重組PV1192基因雙酶切鑒定圖，其中1為VP1061，2為VP1192，M為DNA分子量標準；

圖4為VP1061基因表達與純化產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖，其中1為VP1061，2為VP1192，a為基因表達產物，b為純化產物。

具體實施方式