[發(fā)明專利]一種利用LAMP檢測(cè)溶珊瑚弧菌的引物組、快速診斷試劑盒及檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910192203.4
• 申請(qǐng)日: 2009-09-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101691613A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王江勇;王瑞旋;劉廣鋒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 廣州知友專利商標(biāo)代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國(guó)華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用LAMP檢測(cè)溶珊瑚弧菌的引物組、快速診斷試劑盒及檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

雜色鮑養(yǎng)殖自2001年開(kāi)始，人工繁殖幼苗在附苗后10-21天陸續(xù)發(fā)白、脫落及大量死亡，影響種苗來(lái)源與成貝價(jià)格，危及整個(gè)鮑養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。養(yǎng)殖鮑苗脫落或成鮑死亡疫情，不僅發(fā)生于中國(guó)南方沿海，中國(guó)臺(tái)灣沿海一帶亦發(fā)生類似疾病。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的監(jiān)測(cè)研究，確定引起此大規(guī)?！暗舭灏Y”的主要病原是溶珊瑚弧菌Vibriocorallilyticus，屬于弧菌科弧菌屬。?

為防止該病原菌的傳染和流行是能夠采取的主要措施，早期快速診斷溶珊瑚弧菌是減少損失的有效途徑，因此，簡(jiǎn)便快速、特異性好、靈敏度高的診斷試劑盒及其檢測(cè)方法對(duì)于疾病的預(yù)防意義重大。?

目前常用的檢測(cè)技術(shù)是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為代表的病原核酸檢測(cè)技術(shù)，但是這些檢測(cè)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中存在一些問(wèn)題，如普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)需要專門(mén)的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過(guò)程煩瑣的缺點(diǎn)；熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)雖然較好地解決了交叉污染的問(wèn)題，并簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，但卻需要更復(fù)雜的定量測(cè)定儀器，不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，而且實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)中熒光探針的成本較高，加大了推廣應(yīng)用的難度；免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)快速簡(jiǎn)便成本低廉，但要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的單克隆抗體，否則因準(zhǔn)確性不夠，目前只能是輔助檢測(cè)手段。?

所以及時(shí)運(yùn)用生物技術(shù)發(fā)展的最新成果對(duì)滿足病原微生物檢測(cè)要求的不斷提高具有重要意義。?

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated?isothermal?amplification，簡(jiǎn)稱LAMP技術(shù))，是近年來(lái)新出現(xiàn)的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，具有快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，LAMP主要是利用4種不同的特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)段，在?聚合酶和等溫條件下高效、快速、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，通常是采用染色劑對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析。LAMP中所用到的聚合酶通常都選用具有鏈置換特性的DNA聚合酶，如BstDNA聚合酶。?

對(duì)LAMP來(lái)說(shuō)，4種特異性引物的設(shè)計(jì)是其關(guān)鍵所在，對(duì)于引物設(shè)計(jì)有許多的要求，如各個(gè)引物之間的距離、Tm值以及引物末端穩(wěn)定性等，因此從200～300個(gè)堿基的靶序列中設(shè)計(jì)四條符合要求的引物存在很大的難度。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用LAMP檢測(cè)溶珊瑚弧菌的引物組，該引物組在很大程度上減少了擴(kuò)增反應(yīng)的背景影響，大大改善了溶珊瑚弧菌檢測(cè)的特異性。?

本發(fā)明的目的還在于提供利用上述引物組進(jìn)行LAMP檢測(cè)溶珊瑚弧菌的快速診斷試劑盒，該試劑盒檢測(cè)靈敏度高、擴(kuò)增時(shí)間短，產(chǎn)率高。?

本發(fā)明的目的還在于提供利用上述試劑盒進(jìn)行LAMP檢測(cè)溶珊瑚弧菌的方法，該方法具有快速、高效和高特異性等特點(diǎn)。?

為達(dá)到本發(fā)明的第一個(gè)目的，本發(fā)明提供的利用LAMP檢測(cè)溶珊瑚弧菌的引物組，所述的引物組由下述外引物對(duì)和內(nèi)引物對(duì)組成：?

所述的外引物對(duì)為：?

VCF3：TGGTTGCAGGTGACATCAC?

VCB3：TCTACTGGGCTGTACGTAGC?

所述的內(nèi)引物對(duì)為：?

VCFIP：CATWGCGATCTCAGCGTTGTCTTTTGATCGCTAACCCAGAACACG?

VCBIP：TGGTTACGTTCCAGCTTCAGCTTTCAACCAGTAGGCGACCRAT?

其中W＝A和T；R＝A和G。?

本發(fā)明提供的利用LAMP檢測(cè)溶珊瑚弧菌的快速診斷試劑盒，它含有下述引物組、陽(yáng)性對(duì)照品、LAMP反應(yīng)液、Bst?DNA聚合酶和顯色液。?

所述的引物組由下述外引物對(duì)和內(nèi)引物對(duì)組成：?

所述的外引物對(duì)為：?

VCF3：TGGTTGCAGGTGACATCAC?

VCB3：TCTACTGGGCTGTACGTAGC?

所述的內(nèi)引物對(duì)為：?

VCFIP：CATWGCGATCTCAGCGTTGTCTTTTGATCGCTAACCCAGAACACG?

VCBIP：TGGTTACGTTCCAGCTTCAGCTTTCAACCAGTAGGCGACCRAT?

其中W＝A和T；R＝A和G。?

所述引物組中外引物對(duì)和內(nèi)引物對(duì)的添加摩爾比為1∶1～10。?