[發明專利]多色量子點組合微球編碼的液體芯片及其制備方法和檢測方法

無效

• 申請號: 200910191281.2
• 申請日: 2009-10-30
• 公開（公告）號: CN101812506A
• 公開（公告）日: 2010-08-25
• 發明（設計）人: 羅陽;王玨;府偉靈
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及一種液體芯片，特別涉及一種多色量子點組合微球編碼的液 體芯片，還涉及該液體芯片的制備方法和檢測方法。

背景技術

微生物的種類很多，其中傳染性最強、危害性最重的是細菌、衣原體和 立克次體類病原微生物。病原微生物的傳統檢測是以病原微生物表型特征為 基礎，主要采用分離培養結合形態特性、生化鑒定和免疫分析等方法，存在 操作復雜耗時、條件要求苛刻、陽性率低等缺點，且許多細菌的生化特征和 抗生素敏感型等表型特征不穩定，易受到基因調控、質粒獲失及技術操作等 方面的影響。近年來，以分子生物學為基礎的鑒定方法如質粒分析、核酸雜 交、限制性片段多態性分析和聚合酶鏈式反應(PCR)等，克服了上述病原 微生物傳統檢測方法存在的缺點和客觀因素對其產生的影響，大大提高了檢 測的特異性和準確度，其中生物芯片技術憑借其高通量優勢在病原微生物的 快速偵檢中發揮了重要作用。但常規生物芯片為固體芯片，由于空間位阻的 影響，核酸雜交效率較低。為克服此缺點，液體芯片應運而生。

液體芯片，又稱懸浮陣列，該技術的核心是將聚苯乙烯微球用熒光染色 的方法進行編碼，然后將每種顏色的微球(或稱為熒光編碼微球)共價交聯 上針對特定核酸的探針。應用時，將檢測樣本與多種連有特定核酸探針的微 球同時進行雜交反應，反應完成后，儀器通過兩束激光分別識別編碼微球和 檢測微球上報告分子的熒光強度，從而對靶核酸進行定量檢測。由于整個反 應在液相中完成，反應速度快，雜交效率高，并可以在一個微量反應體系中 同時檢測多達上百條靶序列，尤其適合病原微生物的快速偵檢。然而，近年 研究結果顯示，液體芯片技術尚存在靈敏度較低、重復性較差等不足，其原 因主要是不同熒光標記物的發射光譜在液相中廣泛重疊，導致大量假陽性結 果產生，限制了液體芯片技術在病原微生物偵檢中的進一步推廣應用。因此， 尋找一種能以不同顏色分別標記探針，且發光強度高，不易淬滅，光譜之間 重疊少的熒光標記物是提高液體芯片檢測靈敏度和重復性的關鍵。

量子點(quantum?dots，QDs)的出現為克服以上問題帶來了希望。量子 點是一種由周期表中II-VI族或III-V族元素組成，直徑在1～10nm之間，能夠 接受激發光產生熒光的半導體納米顆粒。與傳統的有機熒光染料相比，量子 點具有許多獨特的理化特性：①發射波長可調諧，可通過控制量子點的粒徑 大小來調節其發射熒光的顏色；②激發波長范圍寬，從紫外區到近紅外區， 可以用同一波長的光激發不同發射波長的量子點；③發射峰狹窄且對稱，半 高峰寬通常為25～45nm；④熒光強度高且穩定，對光漂白有強烈的抵制作用。 量子點的優越熒光性能使其作為新型熒光標記物，在腫瘤活體成像與靶向治 療、分子診斷等領域中已顯示出巨大潛力。但是直接用不同粒徑的量子點制 備多色熒光標記探針時尚存在如下問題，即不同粒徑量子點-探針復合物的最 佳雜交條件是不一致的，因而難以同時實現多色熒光標記探針的檢測條件優 化，這對條件要求較高的核酸雜交實驗結果的影響尤為明顯。為克服以上問 題，有研究者采用將多個量子點組裝于同一粒徑的微球內的方式來實現標記 物質的均一化，通過控制量子點裝配的種類和數量實現了超過1000種顏色的 DNA標記，為多色量子點的生物標記奠定了基礎。

發明內容

有鑒于此，為克服現有技術的不足，本發明的目的之一在于提供一種多色 量子點組合微球編碼的液體芯片，目的之二在于提供所述液體芯片的制備方法， 目的之三在于提供所述液體芯片的檢測方法，從而為病原微生物的快速偵檢及 其它核酸檢測項目提供一種操作簡單、高通量、靈敏度高、重復性好的新方 案。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

1、多色量子點組合微球編碼的液體芯片，由通用引物和至少兩種核酸檢測 系統組成，每種核酸檢測系統由多色量子點組合微球標記的探針P1和磁性微球 標記的探針P2組成；所述探針P1和P2分別與靶核酸序列兩端互補，P1和P2 之間不互補；所述多色量子點組合微球由球體和裝載在球體中的多色量子點組 合物組成；所述多色量子點組合物是從n種具有不同熒光發射波長的量子點中 任取m種組合而成，n和m均為正整數且m≤n；不同核酸檢測系統分別用球體 粒徑相同但熒光發射波長不同的多色量子點組合微球標記探針P1。